研究背景在全球范围内,肝癌的发病率在恶性肿瘤中居于第六位,死亡率排在第四位,严重威胁人类的生命健康。肝细胞癌是一种最常见的恶性肿瘤,在肝癌中占比达到了90%。肝癌患者的早期症状不明显,多数患者被确诊时已经进入晚期阶段。对于晚期肝癌患者,手术治疗等在早期阶段获益大的治疗方式已不适用,主要采用索拉非尼、乐伐替尼等肝癌一线治疗药物进行靶向治疗,从而延长肝癌患者的生存时间。但是由于肿瘤的异质性,药物靶点在不同患者肿瘤组织中的表达存在差异,所以会出现药物不响应和继发性耐药等问题。因此,我们亟需阐明肝癌发生发展的机制,发现新的肝癌药物靶点。牛痘相关激酶1(Vaccinia-related kinase 1,VRK1)是细胞核内的丝氨酸/苏氨酸染色质激酶,参与细胞周期调控、DNA损伤修复、细胞核膜组装、基因转录等重要的细胞生命活动。VRK1在肺癌、乳腺癌、胶质母细胞瘤和食管癌等多种癌症中高表达并与它们的不良预后相关。现有研究表明,VRK1通过调节细胞周期进展促进肝癌细胞的增殖,但VRK1在肝癌迁移和进展中的作用和机制目前尚未有详细阐述。我们利用敲低VRK1的肝癌细胞系,研究VRK1对肝癌细胞增殖和迁移能力的影响,并在裸鼠异种移植瘤模型中验证VRK1对肝癌生物学功能的影响。机制方面,通过RNA测序筛选VRK1调控的下游靶基因以及细胞信号通路,免疫沉淀结合质谱分析确定VRK1的相互作用蛋白。结合上述关键分子的筛选实验阐明VRK1促进肝癌进展的机获悉更多制。研究目的1.研究VRK1对肝癌细胞增殖和迁移能力的影响。2.揭示VRK1在肝癌中调控的关键下游靶基因以及细胞信号通路。3.探究VRK1调控关键下游靶基因并促进肝癌进展的机制。研究方法1.利用TCGA数据库分析VRK1在肝癌患者肿瘤组织中的表达情况以及与肝癌患者生存期和肿瘤分期之间的关系。2.利用CCK8、克隆形成和Transwell实验检测VRK1对肝癌细胞增殖、迁移能力的影响。3.利用裸鼠异种移植瘤模型检测VRK1对体内肿瘤生长的影响。4.利用RNA测序和GSEA,分析VRK1所调控的下游靶基因和细胞信号通路。5.在敲低VRK1的细胞系中回补靶蛋白Snail,利用EdU和Transwell实验检测VRK1是否通过Snail促进肝癌细胞的增殖和迁移。6.免疫沉淀结合质谱分析确定VRK1的相互作用蛋白。7.利用qRT-PCR和Western blotting检测VRK1的相互作用蛋白CHD1L是否介导了VRK1对SNAI1(编码Snail)表达的调控。8.利用Western blotting检测VRK1是否磷酸化修饰CHD1L。9.利用CHD1L的磷酸化位点失活突变体(CHD1L S122A)研究VRK1是否通过CHD1L S122位点的磷酸化调控Snail的表达。研究结果1.VRK1在肝癌中高表达,与肝癌患者预后不良相关TCGA数据库数据分析显示VRK1在肝癌患者肿瘤组织中高表达,并且VRK1高表达的肝癌患者生存期短。随肝癌患者肿瘤分级和分期的升高,VRK1在肿瘤组织中的表达也升高,VRK1与肝癌患者肿瘤恶性程度具有一定相关性。VRK1在肝癌细胞系中的表达也显著高于正常肝细胞。2.敲低VRK1抑制肝癌细胞的增殖和迁移能力与对照组相比,敲低VRK1组Huh7和HepG2细胞的增殖活力降低、克隆形成数目减少,并且细胞迁移率也降低。3.敲低VRK1抑制体内肿瘤生长与对照组相比,敲低VRK1组裸鼠的瘤体积较小,瘤重较轻,裸鼠体重Medial meniscus未有明显波动,表明敲低VRK1抑制体内肿瘤的生长。4.VRK1调控SNAI1表达RNA测序结果显示,对照组与敲低VRK1组之间共存在325个差异表达基因,其中151个基因在敲低VRK1组表达下调,171个基因在敲低VRK1组表达上调。GSEA分析结果显示,差异基因显著富集在上皮-间充质转化通路上,其中间充质主要标志物SNAI1(编码Snail)在敲低VRK1组表达显著下调。qRT-PCR和Western blotting结果证实VRK1调控SNAI1mRNA和蛋白的表达。5.VRK1通过Snail促进肝癌细胞的增殖和迁移挽救实验检测敲低VRK1后回补靶蛋白Snail对肝癌细胞增殖和迁移能力的影响,结果显示VRK1通过Snail促进肝癌细胞的增殖和迁移。6.VRK1与CHD1L相互作用通过免疫沉淀结合质谱分析发现,与对照组相比,在VRK1过表达组中富集的蛋白有175个,其中CHD1L是结合肽段最多的蛋白。经过免疫沉淀实验验证,确认VRK1与CHD1L之间存在相互作用。7.VRK1通过CHD1L调节Snail的表达与敲低VRK1组相比,Snail在敲低VRK1后过表达CHD1L组中蛋白和mRNA的表达量升高,说明VRK1通过CHD1L调节Snail的表达。8.VRK1磷酸化CHD1L S122位点与对照组相比,敲低VRK1组中CHD1L的总体磷酸化水平降低,说明VRK1对CHD1L进行磷酸化修饰;将CHD1L S122位点失活突变为丙氨酸(CHD1L S122A),敲低VRK1不会影响CHD1L S122A的磷酸化水平,说明VRK1磷酸化CHD1L PidnarulexS122位点。9.VRK1通过对CHD1L S122位点的磷酸化调节Snail的表达与敲低VRK1组相比,Snail在敲低VRK1后过表达CHD1L组中蛋白和mRNA的表达量升高,但是在敲低VRK1后过表达CHD1L S122A组中的表达量不会升高,说明VRK1通过CHD1L S122位点的磷酸化调节Snail的表达。研究结论1.VRK1在肝癌组织中高表达并与不良预后相关,VRK1促进肝癌细胞的增殖、迁移和体内肿瘤生长;2.VRK1与CHD1L相互作用并磷酸化CHD1L S122位点;3.VRK1通过磷酸化修饰CHD1L调节Snail表达,促进肝癌细胞的增殖和迁移。