目的:明确胶质母细胞瘤(glioblastoma,GBM)中USP10对RUNX1的去泛素化作用及具体机制,探寻USP10上调RUNX1诱导GBM前神经-间质转化、维持MES亚型特性的机制;分析GBM临床组织样本中USP10与RUNX1的表达关系,判断USP10/RUNX1轴对GBM患者的预后预测价值。方法:1、DUB si RNA文库筛选能够抑制RUNX1蛋白水平的去泛素化酶(Deubiquitinase,DUB),CO-IP探寻能够与RUNX1蛋白存在结合的DUB。在HEK293T细胞将筛选出的去泛素化酶USP10野生型(USP10-WT)、USP10酶功能失活型(USP10-C424A)进行剂量依赖性过表达,并检测对RUNX1蛋白水平影响;利用q RT-PCR检测不同GBM组织亚型(PN,CL和MES)样本中USP10、RUNX1及前神经、间质相关标记基因m RNA表达水平;利用免疫组化、Western Blot检测正常脑组织及不同GBM组织亚型(PN,CL和MES)样本中USP10蛋白水平表达;Western Blot检测正常星形胶质细胞、4个GBM细胞系和2个原代GBM细胞中的USP10蛋白水平;在LN229和GBM2细胞中敲低USP10,Western Blot检测转染USP10-WT或USP10-C424A的质粒后RUNX1蛋白水平。2、在具有PN亚型特性的U251细胞系和GBM1原代细胞表达Vector/USP10或sh Ctrl/sh RUNX1,通过Western Blot检测USP10、RUNX1、PN亚型标记蛋白(Olig2和PDGFRα)和MES标记蛋白(YKL-40、MET和COL5A1)的水平;Transwell实验检测过表达Vector/USP10或sh Ctrl/sh RUNX1后对U251和GBM1细胞侵袭、迁移能力的影响;CCK-8实验检测过表达Vector/USP10或sh Ctrl/sh RUSCH727965浓度NX1后对U251和GBM1细胞增殖能力的影响;裸鼠颅内成瘤实验检测U251和GBM1细胞过表达Vector/USP10或sh Ctrl/sh RUNX1后对肿瘤生长及裸鼠生存期的影响。3、在具有MES亚型特性的LN229细胞系和GBM2原代细胞转染sh Ctrl/sh USP10或Vector/RUNX1,通过Western Blot检测USP10、RUNX1、PN亚型标记蛋白(Olig2和PDGFRα)和MES标记蛋白(YKL-40、MET和COL5A1)的水平;Transwell实验检测转染sh Ctrl/sh USP10或Vector/RUNX1后对LN229和GBM2细胞侵袭、迁移能力的影响;CCK-8实验检测转染sh Ctrl/sh USP10或Vector/RUNX1后对LN229和GBM2细胞增殖能力的影响;裸鼠颅内原位成瘤实验检测LN229和GBM2细胞转染sh Ctrl/sh USP10或Vector/RUNX1后对肿瘤生长及裸鼠生存期的影响。4、在HEK293T细胞中免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitation,Co-IP)、GST pull-down试验明确USP10或USP10(C424A)酶功能失活型与RUNX1是否存在直接相互作用;免疫荧光共聚焦明确USP10和RUNX1在LN229和GBM2细胞中表达是否存在共定位,并通过Co-IP明确USP10和RUNX1在LN229和GBM2细胞中是否存在直接相互作用;构建不同的USP10和RUNX1截短突变体,在HEK293T细胞中进行Co-IP实验以明确USP10蛋白与RUNX1蛋白相互作用的氨基酸区域。5、Western Blot检测在LN229和GBM2细胞中敲低USP10后及加入蛋白酶体抑制剂MG132处理后RUNX1蛋白表达水平;Western Blot明确在MES亚型特性GBM细胞敲低USP10,在PN亚型特性GBM细胞过表达USP10-WT或USP10-C424A对RUNX1蛋白稳定性的影响;Western Blot检测MES亚型特性GBM细胞敲低USP10,PN亚型特性GBM细胞过表达USP10-WT或USP10-C424A对RUNX1蛋白泛素化水平的影响;体外去泛素化实验探讨USP10是否可通过其泛素化酶活性直接切割去除RUXN1蛋白的多聚泛素链直接对RUNX1蛋白进行去泛素化;体外去泛素化实验明确USP10对RUNX1的去泛素化修饰是否由赖氨酸48位点多聚泛素链或赖氨酸63位点多聚泛素链介导;Western Blot检测过表达赖氨酸48位点突变后敲低USP10对RUNX1蛋白表达影响。6、Western Blot检测在LN229和GBM2细胞中给予USP10小分子抑制剂Spautin-1处理对RUNX1蛋白表达及RUNX1蛋白稳定性的影响;Western Blot检测LN229和GBM2细胞经Spautin-1处理对RUNX1蛋白泛素化水平的影响,及U251和GBM1细胞过表达USP10后经Spautin-1处理对RUNX1蛋白泛素化水平的影响;Western Blot检测LN229和GBM2细胞经Spautin-1处理后转染Vector或RUNX1,U251和GBM1细胞过表达USP10后,经Spautin-1处理后转染Vector或RUNX1,PN亚型标记蛋白(Olig2和PDGFRα)和MES标记蛋白(YKL-40、MET和COL5A1)的表达水平;体内及体外检测LN229和GBM2细胞经Spautin-1处理后转染Vector或RUNX1后对肿瘤细胞侵袭、迁移、增殖能力,肿瘤生长及裸鼠生存期的影响。7、免疫组化、Western Blot对比原发为PN亚型、复发为MES亚型GBM患者前后两次手术切除肿瘤组织样本中USP10及RUNX1表达情况;在GBM组织样本中分析USP10和RUNX1表达水平的相关性及USP10表达水平与患者生存期的关系。结果:1、敲低USP10能够抑制RUNX1蛋白水平,USP10与RUNX1蛋白存在相互作用;RUNX1蛋白水平随USP10-WT过表达剂量水平逐渐升高、过表达USP10-C424A对RUNX1蛋白表达无影响;GBM组织MES亚型中USP10、RUNX1及间质相关标记基因m RNA表达水平高于PN亚型、前神经性相关标记基因m RNA表达水平低于PN亚型;USP10在正常脑组织中表达低于GBM组织,且在GBM组织MES亚型中表达水平高于PN亚型;USP10在星形胶质细胞中表达低于GBM细胞,在MES亚型特性的GBMCH-223191纯度细胞中高于PN亚型特性的GBM细胞;过表达USP10-WT能够逆转转染USP10 sh RNA对USP10蛋白的影响,而过表达USP10-C424A无法逆转转染USP10 sh RNA对USP10蛋白的影响。2、U251和GBM1细胞过表达USP10后MES标记蛋白(YKL-40、MET和COL5A1)水平升高、PN亚型标记蛋白(Olig2和PDGFRα)水平下降,敲低RUNX1能够逆转过表达USP10对肿瘤细胞相关蛋白表达的影响;过表达USP10后GBM细胞侵袭、迁移、增殖能力增强,肿瘤生长能力增强、成瘤裸鼠生存期缩短,敲低RUNX1能够逆转过表达USP10对GBM细胞侵袭、迁移、增殖能力,肿瘤生长、成瘤裸鼠生存期的影响。3、LN229和GBM2细胞敲低USP10后MES标记蛋白(YKL-40、MET和COL5A1)水平下降、PN亚型标记蛋白(Olig2和PDGFRα)水平上升,过表达RUNX1能够逆转敲低USP10对肿瘤细胞相关蛋白表达的影响;敲低USP10后GBM细胞侵袭、迁移、增殖能力减弱,肿瘤生长能力减弱、成瘤裸鼠生存期延长,过表达RUNX1能够逆转敲低USP10对GBM细胞侵袭、迁移、增殖能力,肿瘤生长、成瘤裸鼠生存期的影响。4、在HEK293T细胞中USP10野生型或USP10(C424A)酶功能失活型均与RUNX1存在直接相互作用;在GBM细胞中USP10和RUNX1表达存在共定位,并存在直接相互作用;USP10的N端和RUNX1包含Runx结构域的N端为蛋白相互作用的氨基酸区域。5、LN229和GBM2细胞中予MG132处理能够逆转敲低USP10对RUNX1蛋白表达水平的下调;USP10能够促进RUNX1蛋白稳定性,减少RUNX1蛋白泛素化降解水平;USP10通过其泛素化酶活性直接切割去除RUXN1蛋白的赖氨酸48位点多聚泛素链直接对RUNX1蛋白进行去泛素化;过表达赖氨酸48位点突变体后,敲低USP10对RUNX1蛋白表达无影响。6、GBM细胞中予USP10小分子抑制剂Spautin-1处理,RUNX1蛋白表达水平下降、稳定性减弱,泛素化水平降解增多;GBM细胞经Spautin-1处理后PN亚型标记蛋白(Olig2和PDGFRα)表达升高和MES标记蛋白(YKL-40、MET和COL5A1)表达下降,过表达RUNX1能够逆转Spautin-1对GBM细胞的影响;LN229和GBM2细胞经Spautin-1处理后肿瘤细胞侵袭、迁移、增殖能力减弱,肿瘤生长减缓,裸鼠生存期延长,过表达RUNX1能够逆转Spautin-1对GBM细胞裸鼠颅内肿瘤生长、裸鼠生存期影响。7、GBM患者复发为MES亚型肿瘤组织样本中USP10、RUNX1表达水平高于原发PN亚型肿瘤组织;在GBM组织样本中USP10和RUNX1表达水平的存在相关性,USP10表达水平高的GBM患者无进展生存期及总生存期较短。结论:1、USP10是调控RUNX1稳定的去泛素化酶,在MES亚型的GBM中表达最高,USP10上调RUNX1诱导GBM前神经-间质转化,从而Disease transmission infectious维持MES亚型特性;2、USP10与RUNX1存在直接相互作用,从而促进RUNX1的去泛素化修饰,稳定RUNX1蛋白表达;3、USP10抑制剂Spautin-1在体内外诱导RUNX1降解并抑制MES亚型特性;4、GBM临床组织样本中USP10与RUNX1的表达密切相关,对GBM患者预后具有预测价值,USP10/RUNX1轴可能是新的GBM治疗的潜在靶点。