UBE2E2通过调控Snail和NRF2促进卵巢癌转移与进展的机制研究

背景和目的:卵巢癌细胞易于从原发部位脱落,经腹腔种植和淋巴/血行转移,在肠道、大网膜等部位形成难以手术清除的转移灶。上皮-间充质转化(EMT)是参与启动肿瘤细胞转移的主要机制,涉及广泛的表型和分子变化。锌指蛋白SNAI1(亦称Snail,基因名为SNAI1),可调控包括上皮标志物E-cadherin/CDH1等多种基因的表达,是癌症中诱导EMT的关键因子。Snail高度不稳定,可被蛋白酶体快速降解。SQSTM1(sequestosome 1或p62)是连接泛素化和自噬的接头蛋白,近年来,p62被报道在多种疾病模型(胶质母细胞瘤、膀胱肿瘤、心肌纤维化)中,与Snail蛋白的泛素化和降解相关。然而,在卵巢癌细胞中p62是否影响Snail的泛素化和表达水平尚不清楚。泛素化是一种翻译后修饰,参与细胞内大多数蛋白的降解机制,包括SnaiSB203580说明书l和重要的内源性抗氧化分子NRF2。泛素化修饰由泛素激活酶(E1)、泛素结合酶(E2)和泛素连接酶(E3)组成的酶促级联反应完成。E2的功能包括,识别、结合泛素/类泛素(Ub/Ubl)分子并将其传递给E3连接酶和底物,协助决定Ub/Ubl链类型和识别底物特异性,从而参与调控细胞内多种生命活动。本研究通过生物信息学,筛选并分析泛素化通路中与卵巢癌密切相关的基因和酶。结果发现,泛素结合酶E2E2(Ubiquitin Conjugating Enzyme E2E2,UBE2E2)在卵巢癌中高表达,且与临床不良预后相关。UBE2E2(也称为Ubc H8)于1997年被首次报道,随后被证实在多种人类疾病中发挥致病作用,包括2型糖尿病(T2D)、风湿免疫性疾病、帕金森病、非小细胞肺癌和肝癌。此外,UBE2E2与脂肪生成和RR间期相关。然而以上多数研究证据是基于全基因组关联研究(GWAS)和Meta分析,关于UBE2E2的生物学功能仍不明确,尤其有关UBE2E2与卵巢癌的关系国内外未见研究报道。因此,本文后续以卵巢癌A2780、SKOV3细胞和临床卵巢癌组织样本为研究对象,探索UBE2E2在卵巢癌恶性进展和转移中的作用及相关分子机制,对于进一步阐明卵巢癌的致病因素并以此为靶点寻找治疗方法具有参考意义,也希望为发展肿瘤标志物和预后指标提供新的思路。方法:(1)生物信息学:运用在线数据库GEPIA、Oncomine、The Human Protein Atlas、KEGG、KM Plotter分别进行基因表达水平、信号通路分析和生存分析,Schr?dinger program软件进行UBE2E2蛋白质结构模拟。(2)细胞实验:运用CRISPR-Cas9系统构建稳定敲除UBE2E2的A2780细胞系。转染si RNA/质粒载体实现基因敲低/过表达。细胞计数、克隆形成、划痕、Transwell实验检测细胞增殖和迁移能力。q RT-PCR、Western blot、IP实验检测基因的m RNA、蛋白表达水平、Snail蛋白泛素化水平。co-IP检测蛋白间的相互作用。构建不同的UBE2E2突变体和截短体。细胞免疫荧光和核质分离实验检测蛋白在不同细胞组分中的定位和表达情况。(3)动物体内实验:通过手术、腹腔注射,在小鼠体内建立异种卵巢癌原位种植模型、卵巢癌腹腔种植模型。利用小动物活体成像系统对肿瘤进行荧光成像,并进行Western blot和免疫组化检测。(4)临床样本:收集88例卵巢癌和26例正常卵巢Xenobiotic metabolism组织样本,Western blot和免疫组化检测蛋白表达水平。统计卵巢癌患者的临床资料和预后信息进行生存分析。结果:(1)分析TCGA、GTEx和The Human Protein Atlas数据库的结果,以及本研究收集的临床样本检测结果均显示,与正常卵巢组织相比,UBE2E2的m RNA和蛋白表达水平在卵巢癌中升高,DNA水平无显著差异。Kaplan-Meier Plotter数据库和临床样本的生存分析结果均提示,UBE2E2的高表达与临床上卵巢癌患者的不良预后相关。(2)在体外实验中,UBE2E2的沉默会抑制卵巢癌细胞的增殖、迁移能力,使EMT诱导因子Snail、Slug和间质标志物N-cadherin等蛋白表达水平下降,上皮标志物E-cadherin表达增多;而UBE2E2的过表达具有相反作用。(3)UBE2E2的过表达/敲低能够提高/降低卵巢癌细胞中p62的m RNA表达水平,促进/抑制p62蛋白在胞质内的积累,但不显著影响细胞内自噬标志物LC3B蛋白的水平和自噬体的形成。过表达p62可以提高卵巢癌细胞内Snail蛋白的水平,但是co-I此网站P实验没有检测到UBE2E2、p62、Snail蛋白之间的相互作用。UBE2E2的过表达通过降低Snail蛋白的泛素化修饰水平来抑制其降解,进而增强Snail介导的EMT。(4)UBE2E2的过表达/沉默能够分别上调/下调NRF2及其靶基因(抗氧化基因HO-1、GCLC、GCLM和解毒基因NQO1)的表达水平。抗氧化剂t BHQ可明显激活NRF2的表达并诱发其核易位,但这些作用在敲除UBE2E2的细胞中均被显著抑制了。此外,UBE2E2不影响NRF2的m RNA水平。(5)UBE2E2蛋白的UBC结构域(缺失1-52位氨基酸的突变体/截短体Δ1-52)单独表达时,即具有进入细胞核内的功能。与完整的野生型/WT-UBE2E2蛋白相比,活性位点半胱氨酸(Cys139)发生失活突变的C139A-UBE2E2突变体进入细胞核内的功能受阻,对p62和Snail介导的EMT通路的激活作用也受到抑制。(6)WT-UBE2E2、C139A-UBE2E2突变体、UBE2E2蛋白的N端延伸(缺失53-201位氨基酸的突变体/截短体Δ53-201)都具有激活卵巢癌细胞内NRF2通路的作用。Co-IP实验结果显示WT-UBE2E2、C139A-UBE2E2突变体、Δ53-201截短体都能够在卵巢癌细胞内与NRF2蛋白发生相互作用。在敲除UBE2E2的A2780细胞中重新过表达的WT-UBE2E2、C139A-UBE2E2突变体与NRF2蛋白主要共定位于细胞质内。(7)在卵巢癌原位种植模型和腹腔种植模型中,与接种对照组A2780细胞的小鼠相比,接种敲除UBE2E2-A2780细胞组的小鼠体内形成的肿瘤总体积明显更小,平均荧光总辐射度值更弱。小鼠平均体重在组间没有显著差异。与对照组相比,敲除UBE2E2-A2780细胞组小鼠体内形成的肿瘤中,UBE2E2几乎不表达,p62和Snail蛋白表达减少,E-cadherin蛋白的表达增多。结论:(1)UBE2E2在体内、外促进卵巢癌细胞增殖、EMT和转移。(2)UBE2E2通过增强卵巢癌细胞中p62水平,抑制Snail蛋白的泛素化降解而稳定其表达,最终促进Snail相关的EMT,但对细胞自噬无明显影响。(3)UBE2E2通过其N端延伸与NRF2相互作用,UBE2E2全长蛋白激活卵巢癌细胞中NRF2-ARE抗氧化应激系统。(4)UBE2E2的活性位点半胱氨酸(Cys139)发生突变会破坏UBE2E2在卵巢癌细胞内的分布和功能。