Ⅵ型分泌系统(Type Ⅵ secretion systems,T6SS)作为双层跨膜分泌系统参与细菌的不同生物过程,与竞争细菌、宿主和其它环境因素等相互作用中发挥重要作用。T6SS效应蛋白Tae4作为一种裂解酶主要通过作用于细菌细胞壁上的肽聚糖的特殊键位使其断裂从而起到了杀LGK-974试剂灭细菌的作用。近年来,抗生素的长期使用加速了畜禽体内病原耐药性的产生,给人类及动物性食品安全带来了一定的隐患和潜在威胁,因此加强对Tae4蛋白的研究,对后续抗生素减量替代具有重要的意义。本试验先将重组质粒pET-28a-Tae4导入BL21(DE3)pLysS感受态细胞中,通过诱导表达得到重组蛋白Tae4,后通过PyMol等软件对Tae4蛋白进行3D结构建模,经过稳定性试验及注射安全性试验检测重组蛋白的储存性能及安全性。最后评价其对金黄色葡萄球菌及单核增生李斯特氏菌的抑菌效果,MIC以及与抗生素联用效果。本研究为抗生素减量替代提供新的思路,主要研究内容和结果总结如下:1.Tae4蛋白的原核表达纯化及稳定性和安全性测定通过化转将重组质粒pET-28a-Tae4导入BL21感受态细胞中,PCR检测后取阳性菌株进行诱导表达,使用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳对目的蛋白的表达情况进行检测,经条件优化,Tae4蛋白在上清液进行表达诱导最佳条件为:IPTG浓度为0.5mmol/L,温度为16℃,诱导时间为16 h至18 h。利用磁珠对重组蛋白进行纯化,使用终浓度为250mmol/L的咪唑可洗脱分子量大小约为21.5 kDa的单一目的蛋白。使用PyMol等软件成功对Tae4蛋白进行3D模型构建,后续的稳定性试验表明重组蛋白在4℃和37℃条件下处理5 d内未观察到有明显的降解现象。为了评估Tae4的安全性,对小鼠进行注射安全性试验,结果表明各试验组动物的食欲和精神状况良好,未出现死亡情况,皮肤注射部位无炎症、坏死和过敏反应,各器官无出血点、积液等异常反应,各组织均未出现明显病理变化,初步证明了Tae4对小鼠机体无不良影响。2.重组蛋白Tae4对金黄色葡萄球菌的抑菌作用为了探究重组蛋白Tae4对金黄色葡萄球菌(Staphylococcu saureus,S.aureus)的抑制菌效果,首先通过琼脂孔扩散试验进行测试,观察结果发现重组蛋白对3株标准株及3株分离株均有抑菌圈。后续对其进行了最小抑菌浓度(Minimal Inhibit Concentration,MIC)测定,结果显示重组蛋白Tae4对金黄色葡萄球菌的MIC为250μg/mL。选取实验室保存的6株耐药菌株(S.aureus(ATCC 6538)、S.aurProgrammed ribosomal frameshiftingeus 63、S.aureus 67、S.aureus 76、S.aureus 92、S.aureus 93)通过重组蛋白与抗生素联用抑菌试验评价Tae4的抗生素替代效果,结果表明当联用时,对金黄色葡萄球菌的抑制作用得到了一定的增强,在低浓度蛋白与低浓度的青霉素(重组蛋白浓度125μg/mL和PG浓度为200 U/mL)联用时,抑菌效果得到不同程度的提升,且抗生素的使用量得到了降低。3.重组蛋白Tae4对单核增生李斯特氏的抑菌作用为了研究重组蛋白Tae4对单核增生李R428采购斯特菌(Listeria monocytogenes,L.Monocytogenes)的抑菌效果,经过琼脂扩散试验进行测定,结果表明重组蛋白对4株分离株都有抑制作用,而后使用点板法及微量肉汤稀释法对重组蛋白的MIC进行了测定,得出其对单增李斯特的MIC为125μg/mL。最后通过重组蛋白及与抗生素联用试验,将重组蛋白浓度和PG浓度分别调整为125μg/mL和200 U/mL进行效果评价,结果显示抑菌效果均得到了一定的提升。综上所述,本试验成功对T6SS效应蛋白Tae4进行了表达与纯化,并构建了蛋白3D结构,后初步证明了蛋白对小鼠无不良影响且安全无毒害。后续测定了其对金黄色葡萄球菌具有抑菌作用且与青霉素联用时起到了减少抗生素使用量的作用,Tae4对单核增生李斯特氏菌也具有抑菌效果,与青霉素联用时也降低了抗生素的用量,证实了其在抗生素减量方面的可行性。其结果为后续Tae4进一步应用提供理论依据和数据支撑。