2.1 胶质瘤组织中 TＲIM29 蛋白表达与临床特征的关系
TＲIM29 蛋白阳性表达主要定位于胶质瘤及正常脑组织的细胞质中。TＲIM29 在胶质瘤组织中多以强阳性表达，而在正常脑组织中阳性表达较少，多以阴性或弱阳性为主( 图 1) 。Spearman 相关分析结果显示，胶质瘤组织中 TＲIM29 的表达与胶质瘤 WHO 分级呈正相关( r = 0． 535，P ＜ 0． 05 ) ，与年龄、性别无明显相关性( 表 2) 。
A: TＲIM29 在正常脑组织中阴性表达; B: TＲIM29 在胶质瘤细胞中阳性表达
图 1 TＲIM29 在正常脑组织和Selleck R428胶质瘤组织中的表达
( S-P × 200)表 2 TＲIM29 在 56 例胶质瘤标本中的表达及临床病理参数
2． 2 TＲIM29 在胶质母细胞瘤组织及细胞中高表达
因 TＲIM29 的表达与 WHO 分级呈显著正相关，故选取胶质母细胞瘤( Ⅳ级) 组织及其细胞株作为研究对象。Western blot 检测结果显示，相较于癌旁组织及正常组织，TＲIM29 在胶质母细胞瘤组织中的蛋白表达量显著增高( P ＜ 0． 05，图 2) ，同时，TＲIM29 在胶质母细胞瘤细胞株 U-87 MG 中的蛋白表达明显高于其他细胞株，故选择 U-87 MG 细胞用作后续研究。A: TＲIM29 在胶质母细胞瘤组织( 1) 、癌旁组织( 2) 及正常组织( 3) 中的表达; B: TＲIM29 在胶质瘤细胞株中的表达
1: A172; 2: LN-22selleck化学9; 3: U-87 MG; 4: U-118 MG
图 2 胶质瘤细胞、组织及正常组织中 TＲIM29 的蛋白表达
2． 3 在高表达 TＲIM29 的胶质母细胞瘤细胞 U-87 MG 中敲低 TＲIM29
U-87 MG 细胞具有恶性程度高，低分化，生长稳定高的特点。通过对各组 U-87 MG 细胞进行 Western blot 检测，发现 shTＲIM29 组细胞中 TＲIM29 的蛋白表达明显低于空白对照组以及 shScramble 组( P ＜ 0． 05，图 3) 。这说明癌细胞 TＲIM29 基因已被成功敲低。
TＲIM29 表达量
临床病理特征 例数 低表达 高表达 P 值
年龄 0． 063
＞ 40 岁 36 14 22
≤40 岁 20 13 7
性别 0． 455
女性 22 12 10
男性 34 15 19 1: 空白对照组; 2: shScramble 组; 3: shTＲIM29 组
WHO 分级 ＜ 0． 001 A: Western blot 检测结果; B: TＲIM29 蛋白相对表达量
a: P ＜ 0． 05，与空白对照组、shScramble 组比较
图 3 Western blot 检测各组胶质母细胞瘤细胞 U-87 MG 中
TＲIM29 蛋白的表达
2． 4 敲低 TＲIM29 对 U-87 MG 细胞增殖的影响
通过绘制 MTT 生长曲线，发现敲低 TＲIM29 后，明显抑制了 U-87 MG 细胞的增殖能力( P ＜ 0． 05，图 4A) 。同时，肿瘤克隆形成实验也发现，shTＲIM29 组细胞形成的克隆数为( 106 ± 5 ) ，shScramble 组及空白对照组细胞的克隆数分别为( 259 ± 6 ) 、( 266 ± 5 ) ，实验组的克隆数明显低于 shScramble 组及空白对照组 ( P ＜ 0． 05，图 4B) 。这表明 TＲIM29 对 U-87 MG 细胞的增殖起促进作用。
2． 5 TＲIM29 促进 U-87 MG 细胞的迁移能力
采用 Transwell 迁移实验检测敲低 TＲIM29 对 U-87 MG 的迁移能力的影响( 图 5) ，shTＲIM29 组细胞穿膜数为( 91 ± 8) ，明显低于 shScramble 组( 295 ± 12)及空白对照组细胞( 298 ± 14 ) ( P ＜ 0． 05 ) 。这提示 TＲIM29 可促进 U-87 MG 的迁移，敲低 TＲIM29 后，肿瘤细胞的迁移能力明显减弱。
2． 6 TＲIM29 敲低可抑制裸鼠皮下移植瘤的生长
裸鼠皮下成瘤实验结果显示，接种空白对照组及 shScramble 组细胞的裸鼠，约 10 d 形成明显可见的肿瘤结节，而接种 shTＲIM29 组细胞的裸鼠在 15 d左右才形成较为明显的肿瘤结节。通过绘制皮下瘤体体积的生长曲线，发现 shTＲIM29 组皮下瘤体的体积显著小于空白对照组及 shScramble 组( P ＜ 0． 05 ) ;且 shScramble 组及空白对照组之间差异无统计学意义( 图 6A、B) 。为进一步验证敲低 TＲIM29 对胶质母细胞瘤增殖的影响，对取出的皮下瘤体组织进行免疫组化检测 Ki67 的表达水平，发现 shTＲIM29 组皮下瘤体组织中 Ki67 表达明显降低( 图 6C) 。这提示shTＲIM29 组的增殖水平低于空白对照组与 shScramble 组。Selleckchem LY2835219
2． 7 敲低 TＲIM29 对 AKT 通路蛋白表达的影响
Western blot 检测结果显示，shTＲIM29 组细胞 AKT 通路中 p-AKT 蛋白表达相较空白对照组与shScramble 组细胞蛋白表达明显下调( 图 7) 。这说明抑制 TＲIM29 后胶质母细胞瘤细胞 U-87 MG 生物学行为的改变，可能通过 AKT 信号通路。