蛋白质的翻译后修饰(包括甲基化、泛素化、乙酰化等),作为表观遗传学的研究焦点之一,在改变染色质的结构、调控基因的表达以及调节蛋白质的生物功能等方面发挥着重要作用。甲基化修饰作为蛋白质翻译后修饰的一种重要形式,可以调控多种生物进程,如转录沉默和激活、DNA修复和细胞周期控制等。本文在原子/分子水平上,通过系统研究SETD3催化β-肌动蛋白Met73、Lys73甲基化以及DOT1L催化组蛋白H3K79甲基化的动力学性质和能量信息,探讨关键氨基酸残基的突变所引起的酶活性改变的本质原因,进而揭示SETD3和DOT1L的催化机制和产物特异性。具体内容分为以下三部分:(1)SETD3被确认为是β-肌动蛋白中His73-N_3甲基转移酶,His73的甲基化在调节肌动蛋白的生化特性、微调该蛋白的细胞作用、控制磷酸基团的释放通路等方面起着重要作用。进一步的研究表明,SETD3甲基转移酶还可以使其他一些氨基酸残基发生甲基化,包括Met73和Lys73,即它们取代β-肌动蛋白中的His73。SETD3在Met73上Canagliflozin NMR的活性很低,相关实验已经证明SETD3的N255V突变体可以使Met73甲基化的活性增加约3倍,而这种突变导致His73甲基化的k_(cat)却显著降低。然而,突变后Met73甲基化活性增加的详细机制尚不清楚。本研究基于QM/MM分子动力学模拟(MD)与PMF(Potential of mean force)自由能模拟探究SETD3野生酶(WT)及突变体N255V催化H73M甲基化的结构、动力学和能量特征。模拟结果表明:SETD3野生酶催化蛋氨酸甲基化的自由能垒比组氨酸甲基化高约10 kcal/mol,N255V突变体催化蛋氨酸甲基化的自由能垒比野生酶降低约1 kcal/mol。(2)赖氨酸甲基化可以影响一些基本的生物过程,而甲基化的特定生物效应往往取决于通过甲基转移酶添加到赖氨酸残基上的甲基数量(产物特异性)。β-肌动蛋白中目标残基H73突变为K73后,SETD3对K73也有弱的甲基化活性。由于N255→A或N255→F/W273→A的突变,SETD3催化K73甲基化的活性显著增加,突变体的产物特异性也不同于野生酶。关于活性位点的结构特征和动力学如何影响赖氨酸甲基转移酶的活性和产物特异性的问题仍然存在。本研究采用QM/MM分子动力学模拟和PMF自由能模拟探究SETD3野生酶及突变体N255A、N255F/W273A的催化机制和产物特异性,揭示了关键氨基酸残基的突变影响SETD3酶活性改变的本质原因。结果表明:SETD3野生酶催化K73第一次甲基化的自由能垒高于H73甲基化;野生酶催化K73第二次甲基化的自由能垒相比第一次甲基化明显增加,验证了SETD3是赖氨酸单甲基转移酶;N255A突变体催化K73三次甲基化的自由能垒依次降低,酶活性依次增强,所以N255A被认为是一种赖氨酸三甲基转移酶;K73第一次甲基化的活性顺序为N255F/W273A>N255A>WT,与生化实验结果相一致。(3)immune metabolic pathwaysDOT1L作为组蛋白H3K79甲基转移酶DOT1的同源蛋白,在哺乳动物中可以催化H3K79发生单、双、三次甲基化。DOT1L对哺乳动物中胚胎形成和造血过程有重要影响,其异常活化与急性白血病息息相关,也是发展GSK J4试剂药物的一个重要靶点。相关的实验研究表明,DOT1L的催化活性依赖于组蛋白H2BK120单泛素化的协助。组蛋白H4尾部突变体(H4R17A、H4R19A)以及DOT1L loop突变体(F131A、W305A)均影响DOT1L的酶活性。但目前关于DOT1L催化组蛋白H3K79甲基化的反应机制以及关键氨基酸残基的突变改变DOT1L甲基化活性的原因尚不清楚。本研究基于QM/MM分子动力学和PMF自由能模拟,探究DOT1L催化H3K79甲基化的催化机制、关键残基对DOT1L复合物结构的稳定作用及突变体影响酶活性改变的本质原因。结果表明:DOT1L野生酶催化组蛋白H3K79三次甲基化的自由能垒逐渐降低,证明DOT1L是一种赖氨酸三甲基转移酶;H4尾部突变体R17A、R19A催化H3K79第一次甲基化的自由能垒与野生酶第一次甲基化类似,而第二次甲基化的自由能垒明显高于第一次甲基化,酶活性明显减弱;DOT1L loop突变体F131A、W305A催化H3K79第一次甲基化的自由能垒明显高于野生酶,酶活性大大减弱,与生化实验的观察结果相一致。上述模拟结果为进一步认识SETD3、DOT1L的催化机制和产物特异性提供理论依据,并为深入理解表观遗传修饰机制、设计发展有效的药物分子提供新的思路。