猪血凝性脑脊髓炎病毒(Porcine hemagglutinating encephalomyelitis virus;PHEV)属于β冠状病毒属的成员,是目前所知能够感染猪的六种冠状病毒之一。与同属的其他冠状病毒如SARS、MERS及SARS-Co V-2相似,PHEV也可感染猪的上呼吸道而表现出咳嗽、打喷嚏等流感样症状;与同属的其它几种冠状病毒不同的是,PHEV具有典型的神经嗜性,经呼吸道感染后,病毒沿外周神经向中枢神经系统(Central nervous system,CNS)传递,可引起明显的神经症状,呈现非化脓性脑炎和神经退行性病变特征,包括大脑皮质及海马神经元变性坏死、神经元轴突生长发育不良、树突棘形成不稳定以及神经突不规则膨胀和断开等。根据现有文献分析,PHEV感染后的神经入侵及神经损伤是导致宿主发病死亡的重要原因。为了进一步明确PHEV感染及致病的分子机制,本研究从PHEV感染与宿主细胞互作角度进行了系统深入地研究。临床上PHEV主要经呼吸道途径感染,因此本研究利用滴鼻方式接种PHEV模拟自然感染途径建立小鼠感染模型。接毒后6天内小鼠全部死亡,接毒第4天可观察到弓背、尖叫、后肢瘫痪及前肢抖动呈“弹钢琴样”等明显的神经症状。在小鼠体内,病毒主要分布于脑和脊髓,在外周组织中几乎检测不到病毒的存在,表明PHEV具有明显的嗜神经性。在脑组织内,PHEV阳性信号主要定位在神经元,表明神经元为PHEV感染的靶细胞。PHEV感染后引起脑组织明显的病理变化,包括“血管套”形成、神经元变性及丢失、胶质结节等非化脓性脑炎特征,同时可见不同脑区突触数目减少、形成突触的蛋白表达含量降低等神经退行性病变。感染小鼠的临床症状及神经病理变化与发病仔猪高度相似,表明小鼠可作为PHEV致神经损伤研究的理想动物模型。为了进一步阐明PHEV经呼吸道感染后入侵中枢神经系统的途径,首先对接毒小鼠的鼻黏膜及脑组织病毒分布情况进行检测。在感染24 h后即可在鼻黏膜观察到病毒的阳性信号,并且随着感染时间的延长,病毒感染的细胞数量逐渐增加;在脑组织内,感染后第3天,病毒主要分布在嗅球及嗅觉相关的大脑皮质、梨状叶;第5天病毒广泛分布在整个CNS。在感染小鼠的鼻黏膜嗅觉区域可见PHEV与嗅觉神经元共定位,同时病毒阳性信号沿着嗅神经分布,表明PHEV可通过嗅觉神经环路到达嗅球从而进入CNS。使用ZnSO_4和Triton X-100两种药物破坏鼻腔嗅觉神经末梢后可明显推迟小鼠死亡时间,但其对小鼠最终的死亡率及死亡小鼠脑组织病毒载量无显著影响,证明嗅神经可作为PHEV入侵的通路,而且可能存在其他的神经入侵通路。对药物处理后接毒小鼠脑组织的病毒分布情况进行检测,发现病毒抗原首先出现在脑干区域,随着感染时间延长,扩散到整个CNS。免疫荧光结果可见病毒抗原沿着三叉神经分布。以上结果表明,除嗅神经外,PHEV也可通过三叉神经到达脑干完成CNS入侵。在鼻腔内,PHEV主要分布在呼吸区和嗅区,PHEV感染导致呼吸区及嗅区黏膜上皮脱落并伴随炎性细胞浸润;在嗅球内,PHEV主要分布在帽状细胞层,病毒感染导致嗅球产生明显的炎症反应及神经元发育异常;行为学实验结果发现,PHEV感染可导致嗅觉味觉功能障碍。PHEV经外周的嗅神经和三叉神经进入CNS后主要感染神经元,然而,病毒感染过程中神经细胞自身的抗损伤效应是否发挥作用,还不明确。细胞的内质网(Endoplasmic reticulum;ER)可通过激活内质网应激(ER stress;ERS)发挥适应性调节,抵御外界刺激,维系细胞稳态。与其他细胞相比,神经元内含有更加丰富的内质网,即光镜下看到的尼氏体,本研究对神经元这种独特的结构在PHEV感染过Chlamydia infection程中发挥的作用进行了检测分析。研究发现,PHEV感染神经细胞后,在体内和体外均可活化ERS相关的标记分子,并不同程度地激活ERS下游相关的IRE1、PERK和ATF6三条信号通路,体内实验也可得到相同的结论。分别使用药物诱导及缓解ERS,结果发现ERS可负调控病毒复制。由于神经元损伤的不可逆性Decitabine小鼠,ERS介导的抗病毒反应对于降低神经损伤、维持CNS的稳态至关重要。为了筛选ERS发挥抑制病毒作用的通路,分别使用RNA干扰、特异性抑制剂处理及过表达等方法,证明PHEV感染激活的IRE1信号通路不参与PHEV的复制过程,而ATF6信号通路活化后可促进病毒复制,仅仅活化的PERK信号通路具有抑制该病毒复制的能力。深入研究证实,PERK的活化使真核翻译起始因子2α(Eukaryotic initiation factor 2α;e IF2α)发生磷酸化,进而发挥抗病毒作用。对其它几种e IF2α磷酸化激酶的检测结果显示,除PERK外,双链RNA依赖的蛋白激酶(PKR)也可使e IF2α磷酸化而发挥相似的功能。PSBE-β-CD作用ERK与PKR二者协同,共同抑制PHEV复制。最后,本研究对PERK/PKR-e IF2α信号通路发挥抗病毒作用的机制进行了探讨。研究表明,e IF2α作为翻译起始因子在蛋白质的翻译起始过程中起着重要的作用,e IF2α磷酸化可导致翻译起始受阻,从而引起蛋白合成停滞。首先,本研究检测了PHEV感染细胞的蛋白总体翻译水平,结果证明e IF2α磷酸化后可通过降低蛋白质总体翻译水平而实现对PHEV复制的抑制;同时,磷酸化的e IF2α也可促进应激颗粒的形成,药物处理诱导应激颗粒或过表达应激颗粒关键蛋白可明显抑制PHEV的复制。综上所述,经滴鼻方式接种PHEV后,病毒感染鼻腔内的嗅区和呼吸区黏膜,突破黏膜屏障的病毒粒子沿着嗅神经及三叉神经侵入CNS,引起嗅觉味觉等神经功能障碍;感染的神经元可激活ERS效应抑制病毒复制,这种抑制作用是通过PERK与PKR协同作用而使e IF2α发生磷酸化,进而通过减弱整体蛋白翻译水平和促进应激颗粒形成,实现对PHEV复制的抑制。该研究结果不仅明确了PHEV经呼吸道侵入CNS的路径,揭示了ERS在PHEV感染神经细胞过程中的作用,而且对于深入解析PHEV致病的分子机制、发现神经细胞ERS的新特性以及开发潜在抗神经损伤的药物靶标具有重要的参考价值。