猪流行性腹泻(PED)是一种肠道传染性疾病,病原体为猪流行性腹泻病毒(PEDV),主要症状表现为腹泻、厌食及脱水,感染后导致新生仔猪大批量死亡,给养猪业造成了巨大的经济损失。PEDV进入细胞由其刺突蛋白(S蛋白)与宿主细胞受体结合介导,其中S1结构域包含多个受体结合位点,因此常作为开发疫苗和诊断试剂的首选靶点。本研究将截短的S1蛋白进行杆状病毒表达,并以重组蛋白免疫小鼠,制备单克隆抗体,为PEDV S1蛋白的深入研究提供有效检测工具,并以含抗原表位较多的重组蛋白S1_(401-769)为包被抗原,建立间接ELISA方法,为PEDV疫病防控和临床诊断提供技术手段。1.PEDV S1截短蛋白重组杆状病毒表达系统的构建本研究将优化的S1蛋白进Medical officer行序列截短,获得1～400 aa和401～769 aa两个片段,将扩增的片段与p Fast Bac1载体连接,获得重组质粒p Fast Bac1-S1_(1-400)和p Fast Bac1-S1_(401-769)。将重组质粒转座至DH10Bac感受态细胞中,构建重组杆状病毒穿梭质粒,然后将质粒转染至Sf9昆虫细胞中进行表达,通过IFA和Western Blot验证,结果表明在昆虫细胞中成功表达出了重组S1_(1-400)和S1_(401-769)两个蛋FG-4592使用方法白,并且均表达在破碎后的细胞上清中。SDS-PAGE和Western Blot结果表明表达的蛋白能与PEDV阳性血清发生特异性反应。2.PEDV S1截短蛋白单克隆抗体的制备利用杆状病毒表达出的重组蛋白S1_(1-400)和S1_(401-769)分别免疫小鼠,在进行四次免疫后检测小鼠血清效价,当效价达到1:5120后进行加强免疫,取免疫小鼠的脾细胞和骨髓瘤细胞进行细胞融合。运用间接ELISA方法对杂交瘤细胞进行筛选,经过3次亚克隆最终获得3株能稳定分泌抗体的阳性细胞株,运用Western Blot方法对其进行验证,最终获得2株针对PEDV S1_(1-400)的单克隆抗体,命名为400C5和400G8,1株针对PEDV S1_(401-769)的单克隆抗体,命名为769H4。3.PEDV S1_(401-769)间接ELISA方法的建立以重组蛋白S1_(401-769)为抗原进行蛋白包被,运用方阵滴定法确定最佳包被浓度为0.25μg/m L,血清最佳稀释比为1:40,按照此条件,同样摸索出最佳封闭液和封闭时间为5%BSA封闭2 h,血清37℃孵育1.5 h,HRP-羊抗猪IgG二抗以1:5000的稀释比在37℃孵育30 min。按照此优化的间接ELISA条件检测64份临床血清样品,并与国产商品化试剂盒检测结果对比。结果显示,PEDV IgG抗体间接ELISA检测方法的总符合率为81.25%(52/64),证实所建立的间接ELISA方法灵敏性良好。综上,本试验构建了PEDV S1_(1-400)和S1_(401-769)的重组杆状病毒,并利用此重组杆状病毒在昆虫细胞中稳定表达S1截短蛋白。将表达的蛋白免疫小鼠,成功筛选到3株针对PEDV S1截短蛋白的单克隆抗体细胞株,为今后深入研究PEDV S1蛋白奠定了基础。以杆状病毒表达的重组蛋白S1_(40GSK J41-769)包被酶标板,建立了可检测PEDV S1截短蛋白的间接ELISA方法,为PEDV的防控提供有效工具。