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目的:本研究通过观察中药离子导入结合乳块消糖浆治疗前后乳腺增生病患者乳房疼痛、乳房肿块及中医证候变化情况,并与中药非离子导入结合乳块消糖浆治疗相比,客观评价中药离子导入结合乳块消糖浆治疗肝郁痰凝型乳癖的临床疗效,寻求治疗乳腺增生症的新思路。方法:选取黑龙江中医药大学附属第二医院外科门诊就诊的乳腺增生病患者,按照纳入标准筛选入组65例,随机分为观察组33例、对照组32例,观察组予中药离子导入+乳块消糖浆治疗,对照组予中药非离子导入+乳块消糖浆治疗。两组均从月经结束后入组治疗,至下个月经周期相应日期为1个疗程,共治疗2个疗程。口服药治疗的同时加入中药(非)离子导入治疗。口服药3次/日,经期停药。离子导入治疗1次/日,1个疗程共治疗15次,经期停止治疗。治疗2个疗程后,观察两组治疗前后乳房症状(VAS疼痛评分、疼痛持续时间)以及乳房体征(触痛、肿块大小、质地、范围评分)和中医全身证候评分的变化情况,并使用SPSS26.0对数据进行统计学分析。结果PLX4032 IC50:本试验实际完成全程治疗62例(观察组脱落2例,对照组脱落1例),观察组与对照组各完成31例。中药此网站离子导入结合乳块消糖浆组总有效率为90.32%,中药非离子导入结合乳块消糖浆组总有效率为74.19%,经SPSS软件比较分析,P<0.05,说明观察组有效率高于对照组。在改善乳房VAS疼痛评分、疼痛持续时间以及乳房压痛、肿块大小、肿块范围及部分中医全身证候(包括胸胁胀闷、急躁易怒)方面,P<0.05,差异有统计学意义,表明观察组疗效优于对照组。在乳房肿块质地及部分中医全身证候(包括心烦失眠、经行腹痛),P>0.05,差异无统计学意义,表明观burn infection察组疗效与对照组无明显差异。结论:中药离子导入结合乳块消糖浆治疗乳腺增生病患者总体疗效良好,且高于中药非离子导入结合乳块消糖浆治疗。在减轻乳房疼痛程度、缩短疼痛时间、缩小肿块大小和分布范围的同时,可以有效缓解患者胸胁胀闷、急躁易怒的中医全身证候,提高患者的生活质量。

目的 探讨骨髓增生异常综合征患者感染的影响因素。方法 回顾性分析南阳市第二人民医院2020年1月-2022年11月收治的248例骨髓增生异常综合征患者的临床资料，根据感染情况分为感染组(n=59)和未感染组(n=189selleck合成),采用多因素Logistic回归分析骨髓增生异常综合征患者感染的影响因素，并构建回归方程，采用受试者工作特征(ROC)曲线分析回归方程对骨髓增生异常综合征患者感染的预测价值。结果 多因素LAG-221小鼠ogistic回归分析结果显示，合并糖尿病、使用糖皮质激素、使用地西他滨是骨髓增生异常综合征患者感染的危险因素(OR=4.3MSC necrobiology09、2.777、4.959,P<0.05),血清白蛋白、使用粒细胞集落刺激因子是骨髓增生异常综合征患者感染的保护因素(OR=0.343、0.878,P<0.05);ROC曲线分析结果显示，回归方程预测骨髓增生异常综合征患者感染的曲线下面积(AUC)值为0.824,敏感度为77.97%,特异度为71.96%。结论 根据骨髓增生异常综合征患者感染影响因素构建相关的回归方程预测价值较好，临床可采用此回归方程对骨髓增生异常综合征患者感染的风险进行预测。

目的 分析血小板膜糖蛋白(GP)特异性抗体在免疫性血小板减少症(ITP)患儿中的表达情况及其与疗效、出血程度的关系。方法 选取2018年2月至2020年12月于唐山市妇幼保健院儿科就诊的102例ITP患儿为研究对象，并将其纳入病例组，另选取同期同院进行体检的110例健康儿童纳入健康3-Methyladenine试剂组。病例组患儿均接受糖皮质激素冲击疗法，以4周为1个疗程，共治疗5个疗程，并随访3个月。检测并比较两组GP特异性抗体表达情况，统计ITP患儿出血部位并分析不同GP特异性抗体出血程度、疗效及预后。结果 病例组抗GPⅠb/Ⅸ抗体、抗GPⅡb/Ⅲmedically illa抗体表达水平高于健康组，差异有统计学意义(t值分别为16.521、51.718,P<0.05);102例ITP患儿抗GPⅠb/Ⅸ抗体阳性、抗GPⅡb/Ⅲa抗体阳性、双抗体阳性、双抗体阴性检出率分别为15.69%、4.90%、30.39%、49.02%,0级、1级、2级出血率分别为16.67%、50.00%、33.33%;且0级出血以双抗体阳性占比(0)最低，1级出血以抗GPⅡb/Ⅲa抗体阳性占比(80.00%)最高，2级出血以selleck产品抗GPⅠb/Ⅸ抗体阳性、双抗体阳性占比(62.50%、48.39%)较高，差异有统计学意义(H=38.237,P<0.05);102例ITP患儿治疗5个疗程后有效率为78.43%,随访3个月后完全缓解率为68.63%;双抗体阴性ITP患儿有效率、完全缓解率均高于抗GPⅠb/Ⅸ抗体阳性、抗GPⅡb/Ⅲa抗体阳性、双抗体阳性ITP患儿，差异有统计学意义(χ~2值分别为19.866、27.709,P<0.05)。结论 ITP患儿抗GPⅠb/Ⅸ抗体、抗GPⅡb/Ⅲa抗体表达水平较高，且其不同表达水平与患儿出血程度、疗效及预后均有密切关系，临床可通过监测GP特异性抗体来对ITP患儿进行早期诊断，并对其出血程度、疗效、预后等进行预测。

目的 探究多配culture media体蛋白聚糖-1(SDC-1)在肝纤维化进程中的作用机制。方法 选择2021年4月至2023年4月于三二〇一医院住院治疗并行肝穿刺活体组织病理检查的102例慢性乙型肝炎患者作为研究对象。采集患者的空腹静脉血，采用ELISA法检测患者血清SDC-1的表达水平，并SCH772984 NMR比较不同肝纤维化分期患者血清SDC-1表达水平的差异。观察经转化生长因子-β1(TGF-β1)诱导活化的LX-2细胞中SDC-1表达水平的变化，以及敲低SDC-1表达对活化的LX-2细胞中α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）、血小板反应蛋白1(THBS1)表达水平及细胞增殖、细胞周期的影响。结果 随着肝纤维化程度逐渐加重，慢性乙型肝炎患者血清SDC-1的表达水平呈升高趋势（P<0.05）。与阴性对照（NC）组相比，TGF-β1组α-SMA、SDC-1蛋白及其m RNA的相对表达量均显著升高，细胞增殖活性显著增强，G1期细胞占比显著降低，S期和G2期细胞占比显著升高（P均<0.05）。与NC小干扰RNA(si RNA)组相比，SDC-1si RNA组α-SMA、TGF-β1、THBS1蛋白及其m RNA的相对表达量均显著降低，细胞增selleck NMR殖活性显著减弱，G1期细胞占比显著升高，S期和G2期细胞占比显著降低（P均<0.05）。结论 敲低SDC-1表达可能通过调控TGF-β1/THBS1信号通路，抑制肝星状细胞（HSC）的活化及增殖，阻滞HSC由G1期进入S期和G2期，进而发挥抑制肝纤维化进展的作用。

目的 探讨经尿道前列腺Imidazole ketone erastin纯度等离子切除术（PKRP）后患者护理服务需求的影响因素。方法选取2021年1月至2022年7月在医院行PKRP的82例患者，评估所有患者术后护理服务需求情况[支持性照顾需求问卷（SCNS）评分]，设计基线资料调查表，详细统计所有患者的基线资料，比较不同资料特征PKRP后患者的SCNS评分，重点分析PKRP后患者护理服务需求的影响因素。结果 经https://www.selleck.cn/products/Nolvadex.html评估82例PKRP后患者的SCNS评分为（128±11）分；不同年龄、受教育程度、社会支持及家庭月人均收入PKRP后患者的SCNS评分比较，差异有统计学意义（P<0.05），其他不同资料特征PKRP后患者的SCNS评分比较，差异无统计学意义（P>0.05）；经多元线性回归分析结果显示，受教育程度低、年龄大、社会支持低下及家庭月人均收入低均是PKRP后患者护理服务需求的影响因素（P<0.05）。结论 PKRP后患者存在中高水平的护理服务需求，受教育程度低、年龄大、社会支持低下及家庭月人均收入structural bioinformatics低均是PKRP后患者护理服务需求的影响因素。

目的 研究乙酰肝素酶（HPSE）对胆囊癌细胞侵袭迁移以及ERK/MMP-9信号通路作Biotin cadaverine用机制。方法 在胆MAPK抑制剂囊癌细胞（GBC-SD）中采用慢病毒转染的方法双向调节HPSE基因的表达，获得转基因过表达HPSE的胆囊癌细胞株和HPSE极低表达的胆囊癌细胞株，qRT-PCR和Western blot检测过表达及干扰效果。利用Transwell及细胞划痕实验分别检测转染后阴性对照组、HPSE敲低组及过表达组胆囊癌细胞侵袭及迁移能力。同时，qRT-PCR检测HPSE、MMP-9 mRNA转录水平，Western blot检测MMP-9、HPSE、p-ERK、ERK、N-cadherin及E-cadherin蛋白表达水平。结果 HPSE基因过表MRTX849生产商达组和干扰组胆囊癌细胞株成功构建（P <0.05）。过表达HPSE显著促进胆囊癌细胞的迁移及侵袭，同时MMP-9 mRNA和蛋白表达及p-ERK、N-cadherin蛋白表达均上调，E-cadherin表达下调；敲低HPSE表达后情况相反（P <0.05）。另外，过表达HPSE与ERK抑制剂共同处理逆转了HPSE基因过表达对胆囊癌细胞生物学功能的促进作用（P <0.05）。结论 乙酰肝素酶通过激活ERK信号通路上调MMP-9增强胆囊癌细胞的侵袭迁移能力。

目的 基于内质网应激（Endoplasmic reticulum stress,ERS）信号通路PERK/eIF2α/ATF4/CHOP探讨枳葛口服液含药血清对BRL-3A大鼠肝细胞损伤的保护作用及机制。方法 (1)制备含药血清：SD雄性大鼠随机分为3组：枳葛口服液组、美他多辛组、正常组，分别予以枳葛口服液、美他多辛及生理盐水灌胃，连续干预5天，腹主动脉取血制备含药Nirmatrelvir抑制剂血清。(2)培养正常BRL-3A大鼠肝细胞，用不同浓度乙醇（1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%、5.0%、7.0%、10.0%）干预细胞24 h后用CCK-8法测定各组细胞存活率。(3)BRL-3A大鼠肝细胞分为正常组，模PLX-4720体内实验剂量型组，美他多辛组，枳葛口服液低、中、高剂量组（后简称为低剂量组、中剂量组、高剂量组）。24 h后测定各组细胞上清液中γ-谷氨酰转肽酶（GGT）、乳酸脱氢酶（LDH）水平，CCK-8检测BRL-3A细胞存活率，Real-time PCR及Western blot检测各组细胞内PERK/eIhepatopancreaticobiliary surgeryF2α/ATF4/CHOP通路相关mRNA及蛋白表达水平。结果 (1)不同浓度乙醇（1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%、5.0%、7.0%、10.0%）干预细胞24 h后，细胞存活率随着乙醇浓度的升高呈逐渐下降趋势，当乙醇浓度为5%时，细胞存活率明显下降（P<0.05），故选择乙醇浓度为1.0%、1.5%、2.0%、2.5.0%、3.0%、5.0%进行后续实验。(2)与正常组相比，模型组上清液中GGT、LDH含量显著升高（P<0.05）,PERK/eIF2α/ATF4/CHOP通路相关因子mRNA和蛋白的表达显著升高（P<0.05），呈现明显肝损伤状态。(3)与模型组相比，枳葛口服液组及美他多辛组以上指标均呈现不同程度的降低，其中枳葛口服高剂量组效果最显著（P<0.05）。结论 枳葛口服液含药血清能够改善乙醇诱导的BRL-3A大鼠肝细胞损伤，其机制可能与抑制内质网应激PERK/eIF2α/ATF4/CHOP信号通路有关。

目的 ：建立结核杆菌侵染破骨细胞（osteoclasts,OC）模型，探讨结核杆菌侵染OC后对骨质破坏相关因子表达的影响。方法：采集健康志愿者的外周全血，分离出外周全血中的单核细胞（peripheral blood mononuclear cells,PBMCs），利用核因子κB受体活化因子配体（receptor activator of nuclear factor-κB ligand,RANKL）以及巨噬细胞集落刺激因子（macrophage-colony stimulating factor,M-CSF）诱导使其成为OC，对细胞进行抗酒石酸酸性磷酸酶（tartrate resistant acid phosphatase,TRAP）染色。将已经构建好的具有卡那霉素（Kana）抗性的H37Rv pMV261-GFP绿色荧光结核菌株进行复苏并加入10%的油酸、白蛋白、葡萄糖和过氧化氢酶添加剂（oleic albumin dextrose catalase,OADC）、7H9以及含卡那霉素的结核杆菌专用液体培养基进行培养，放置于37℃的恒温箱中培养至光密度（optical density,OD）值为600nm时的0.5左右备用；以单纯Odiagnostic medicineC培养为空白对照组；用结核杆菌以不同转染复数（multiplicity of infection,MOI）侵染OC 24h，采用MTT比色法检测细胞存活率最高的MOI为后续实验MOI，使用H37Rv以此MOI侵染OC为实验组；荧光显微镜及结核杆菌抗酸染色分别观测实验MOI时结核杆菌转染情况。实时荧光定量PCR (real time fluorescence quantitative PCR,qRTPCR)检测非受体酪氨酸激酶（C-src）、蛋白激酶K(cathepsin K,CK)、碳酸酐酶2(carhttps://www.selleck.cn/products/gdc-0068.htmlbonic anhydrase 2,CA2)、整合素-β3(integrin-β3)、基质金属蛋白酶-9(matrix metalloproteinase-9,MMP-9)的表达情况；免疫组化（immunohistochemistry）检测磷酸化酪氨酸激酶产物（P-src）、CK、CA2、Integrin-β3、MMP-9的细胞表面蛋白表达情况；蛋白免疫印迹（western blot,WB）检测P-src、CK、CA2、Integrin-β3、MMP-9的蛋白表达水平。结果：TRAP染色显示细胞培养15d后90%以上为OC，可以用于进行实验。荧光结核杆菌成功将其OD值培养为600nm时的0.5。MTT比色法结果显示：在MOI为20∶1时细胞存活率最高（P<0.05），此为实验组MOI；结核杆菌侵染OC后荧光显微镜显示：MOI为20∶1时，绿色荧光标记Blebbistatin临床试验的结核杆菌进入OC，说明成功转染OC；结核杆菌侵染OC后抗酸染色结果显示：MOI为20∶1时，被染成红色的抗酸结核杆菌进入OC，说明结核杆菌H37Rv成功转染OC。qRT-PCR、细胞免疫组化、WB检测结果均显示：MMP-9、CK、C-src、CA2、Integrin-β3的表达实验组均高于空白对照组（P<0.05）。结论：结核分枝杆菌能够转染OC；与空白对照组相比，结核杆菌转染OC的实验组中5种具有骨质破坏作用因子均升高，提示结核骨质破坏可能与此相关，为骨结核疾病诊疗提供新的探索方向。

目的:对鸡血藤总黄酮提取物中的黄酮类成分进行辨识和鉴定，并对其治疗骨质疏松的靶点进行预测，观察其对核因子κB受体活化因子配体(sRANKL)诱导RAW264.7向破骨细胞分化的影响，并对破骨细胞分化产生影响的作用成分及作用机制进行探讨。方法:采用液相色谱-离子阱-静电轨道阱杂交质谱(HPLC-LTQ/Orbitrap MS)法采集数据后，对各色谱峰的质谱图高分辨一级和二级质谱数据进行解析，与文献数据库进行对比，对各色谱峰进行结构推测和确认。运用Swiss Target Prediction、GeneCards、String平台预测鸡血藤总黄酮18个成分与骨质疏松相关的潜在靶点，在DAVID 6.8平台进行基因功能富集和KEGG通路富集分析，Cytoscape软LY2157299纯度件构建“成分-靶点”网络。体外培养RAselleck产品W264.7细胞，sRANKL诱导破骨细胞分化，鸡血藤总黄酮干预后，通过抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)活性检测盒TRAP染色法评价破骨细胞形成和分化能力，Western blot法检测雌激素受体(Estrogen receptor, ESR)相关蛋白的表达。结果:从鸡血藤总黄酮提取物中共鉴定了18个黄酮类化合物(芒柄花素、染料木素及美迪紫檀素等),网络药理学预测共得到鸡血藤黄酮化合物治疗骨质疏松的潜在共同作用靶点33个，筛选出16条与骨质疏松相关的信号通路。GO分析和KEGG分析显示关键靶点涉及催乳素(Prolactin)、内分泌(Endocrine)、雌激素(Estrogen)、缝隙连接(Gap junction)、酪氨酸激酶受体(ErbB)、等信号通路，生物过程主要涉及以DNA为模板的转录调控、蛋白质自磷酸化、血管收缩的正向调节、等；分子功能涉及蛋白酪氨酸激酶活性、跨膜受体蛋白酪氨酸激酶活性及类固醇结合等；细胞组分涉及细胞膜上的膜筏、原生质膜、神经元末端、等。实验验证结果显示：与正常对照组相比，sRANKL 50 ng/mL组耐酒石酸盐酸性磷酸酶(TRAP)活性明显升高，ESR1、ESR2蛋白表达明显下调(P<0.05或P<0.01),与sRANKL 50 ng/mL组比较，鸡血藤总黄酮50μg/mL组TRAP活性明显降低(P<0.05);TRAP阳性细胞随着鸡血藤总黄酮组浓度的增大逐渐减少；鸡血藤总黄酮Triterpenoids biosynthesis25、 50μg/mL组ESR1、ESR2蛋白表达明显上调(P<0.05或P<0.01)。结论:鸡血藤总黄酮中多种黄酮成分具有调节雌激素的作用，其通过与雌激素受体结合，抑制sRANKL诱导RAW264.7向破骨细胞分化，从而起到预防骨质疏松的作用。

肝脏作为体内最大的消化器官,其重量约为人类体重的2%。肝细胞和胆管上皮细胞(biliary epithelial cells,BEC)作为肝脏的主要组成部分,参与肝脏代谢、解毒、合成胆汁等重要生理功能。稳态下,肝脏细胞相对静息,缓慢的肝细胞自我更替便可以满足肝脏代谢需求。然而,急性损伤状态下,大量新生的肝细胞迅速填充受损肝脏,最终实现肝功能的修复。尽管如此,大量患者面临着急性肝衰竭或慢性肝脏损伤导致的肝脏再生能力下降,随之而来的肝脏纤维化及终末期肝病(end stage liver disease,ESLD)成为临床治疗中亟待解决的问题。由于供体肝脏的短缺,原位肝移植(orthotopic liver transplantation,OLT)作为终末期肝病行之有效的治疗策略备受限制。因此,寻找有效的替代治疗方案成为治疗终末期肝病的迫切需求。随着干细胞与再生医学的发展,细胞治疗在终末期肝病等重大疾病的治疗中展现出可喜的前景。由于缺乏充足的原代肝细胞和有效的体外分离、维持培养、体外保存及体内再殖效率、移植后免疫排斥反应而无法广泛的临床应用。因此,如何维持体外长期、高效扩增原代肝细胞,实现体内高效定植成为细胞治疗终末期肝病领域的核心问题之一。发掘可用于临床移植治疗、数量充足和体内具有再殖能力的种子细胞,并通过体内移植实现对肝衰竭救治功能的验证依赖于理想的体内模型。本课题组前期的工作中,停止给予NTBC(2-(2-硝基-4-三氟甲基苯甲酰基)-1,3-环己二酮)后,Fah缺陷的小鼠肝脏迅速损伤坏死(受体小鼠)。然而,通过脾脏注射外源的Fah阳性肝细胞后(供体细胞),Fah阳性细胞在2-3个月的时间内迅速替代宿主Fah阴性细胞,并且受体小鼠也获得了代谢酪氨酸的能力从而避免了肝细胞坏死和肝脏衰竭。因此,原代肝细胞移植Fah缺陷小鼠模型成功实现了肝细胞移植治疗肝衰竭。此外,在异种移植的过程中,通过对重度免疫缺陷的Fah缺陷小鼠(Fah~-/-/Rag2~(-/-)/Il2rg~(-/-))进行尿激酶腺病毒预处理,人肝细胞的长期再殖效率高达90%。由此可见,利用Fah缺陷小鼠的肝脏再生模型探究肝细胞命运调控机制蕴含着巨大的潜力。近年来,单细胞组学技术和细胞示踪技术的蓬勃发展,使得单细胞层面观察、示踪、分析细胞的类型和状态变得更为便捷。因此,单细胞技术及细胞示踪技术的发展为探究不同状态下肝脏再生中细胞之间复杂的相互作用提供了新的思路,有助于进一步了解肝脏的空间分布特征以及不同区域的肝细胞对肝再生的作用。本研究中,利用单细胞测序技术和细胞示踪技术,我们探究了肝细胞移植后的肝再生过程中,移植细胞状态的变化、分区特征,以及细胞再生肝脏的机制。通过对机制探究和明确,为突破肝细胞移植治疗终末期肝病的临床应用瓶颈提供可行的干预手段,进一步优化肝细胞移植治疗在终末期肝病的临床应用。第1章单细胞组学揭示肝细胞移植后发生去分化改变目的:探究宿主Fah~(-/-)小鼠肝脏内定植的外源肝细胞变化规律方法:1.构建C57BL/6背景的Rosa26-LSL-td Tomato转基因小鼠,同时构建腺相关病毒8(AAV8-TBG-Cre),通过尾静脉注射进行体内转染使得成熟的肝细胞携带红色荧光;2.构建C57BL/6背景的Fah基因缺陷小鼠,通过喂食7.5%的NTBC饮用水维持小鼠肝脏酪氨酸的代谢;3.将受体小鼠分为两组对照组(Sham组)和移植组,分别检测移植后3周、6周、9周、12周的小鼠肝功能相关血清学指标。通过RT-PCR、免疫荧光染色检测移植细胞td Tomato、AFP、H19、Tnfrs12a、Id3、Ki67、MCM2、PCNA、Ccnd1的表达;4.通过流式分选肝脏单细胞悬液获得移植后小鼠肝脏中的外源移植细胞及其子代细胞(标记为红色荧光),用于制备单细胞测序样本。结果:1.空载体组和病毒转染组的血清学肝功能指标结果在不同时间点无显著性差异;H&E染色显示肝小叶结构清晰,排列紧密;2.停止给予含有NTBC的饮用水后,Sham组的小鼠在2-3周左右迅速出现弓背、竖毛。大约在5周左右,90%的Sham组小鼠死亡。血清学检测显示小鼠ALB水平逐渐下降,伴随ALT、AST、TBIL的水平上升。与之相比,移植组小鼠状态良好,大部分的小鼠存活至9-12周。小鼠体重时间变化曲线显示,移植组小鼠在3周左右降至最低点,随后逐渐恢复至移植前水平。肝脏H&E染色显示:移植组小鼠在移植后6周肝小叶结构恢复正常;3.单细胞测序显示:经过严格的质量控制和标准化,将捕获的28342个高质量细胞划分成13个细胞簇。基于差异表达基因,进一步将13个细胞簇分为2个群体(group1和group2);4.通过比较两个群体肝干细胞标志物的表达情况,发现group1群体上调AFP、H19水平,同时上调肝再生相关基因Tnfrs12a和肝母细胞标志Id3的表达。通过RT-PCR和免疫荧光染色对肝脏组织中AFP、H19、Tnfrs12a、Id3进行了验证。通过与经典的三级胆道重编程进行比较,移植细胞上调表达肝细胞谱系相关基因,同时下调表达胆管谱系相关基因。结论:1.利用腺相关病毒可以高效、安全的标记小鼠肝脏成熟肝细胞。通过流式分选的方式可以实现成熟肝细胞的体外分选,并通过脾脏移植肝细胞挽救Fah基因缺陷小鼠;2.移植后3周,肝脏中外源移植细胞发生去分化,并伴随肝细胞增殖能力上调;3.移植的肝细胞在去分化过程中维持自身谱系稳定性,调控肝细胞去分化并促进肝再生。第2章肝再生过程中肝脏分区的变化及规律研究目的:探究肝再生过程中肝脏分区特征的变化规律方法:1.构建基于成熟肝细胞的Fah基因缺陷小鼠移植模型,分析移植前和移植后3周,6周,12周移植单细胞测序结果;2.基于Halpern开发的肝细胞基因分区算法,检测不同时间点移植细胞及其特定亚群的分区特征完整性和倾向性;3.利用分区特征性基因及多色荧光染色定义肝脏分区,观察野生型小鼠和Fah~(-/-)小鼠断药non-necrotizing soft tissue infection(off NTBC组)后肝脏分区的变化,观察并统计td Tomato标记的移植细胞及其子代细胞在不同肝脏分区中的比例变化;4.通过鬼笔环肽对肝细胞骨架的染色,观察off NTBC组肝脏不同区域的损伤程度;5.通过AFP及分区标志的荧光共染,观察off NTBC组肝脏细胞AFP的分区特征。结果:1.经典的分区特征基因对Cyp2f2、Cyp2e1和Glul、Ass1,后续的聚类分析展现出正确的互斥型分布;2.肝再生中期6周和肝再生终末期12周的小鼠肝细胞与移植前的肝细胞类似,二者具有完整的肝脏分区和清晰的层次。然而,在肝再生早期3周的样本中,出现了一群分期特征模糊的细胞,同时上调Hamp2,、Igfbp2表达。从分空间分Belumosudil化学结构布上来看,3周样本过渡到6周样本时,分区特征逐渐偏离PV区。到12周时,分区特征又重新恢复到移植前的状态;3.通过分区特征基因的荧光染色结果表明,野生型小鼠肝脏分区特征完整,位于CV区附近的肝细胞呈现GS~+,位于PV区附近的肝细胞呈现E-CAD~+,位于二者中间的过渡区域呈现GS~-E-CAD~-;4.Off NTBC组1周、3周的小鼠肝脏中,E-CAD~+肝细胞逐渐增加,并朝向中间区域过渡,GS~+的肝细胞保持相对稳定。鬼笔环肽染色显示断药后小鼠肝脏损伤并没有分区特征。AFP与分区标志共染显示,断药后早期宿主AFP~+细胞存在显著的PV分区偏倚;5.供体小鼠中,td Tomato~+成熟肝细胞均匀的分布在不同区域之间。移植后宿主肝脏细胞分区特征减弱,td Tomato~+肝细胞从PV区域逐渐过渡到中间区域,最后填充CV区并恢复肝脏分区特征。结论:1.肝再生过程中,移植细胞从PV区开始,沿着中间小叶区逐渐过渡到CV区并最终填充整个肝脏;2.初始的移植细胞具备显著、规律的分区特征,并在移植后早期减弱分区,同时伴随部分无分区偏倚的移植肝细胞发生去分化并表达AFP,最终恢复肝脏分区特征;3.有区域分布偏倚的宿主AFP~+肝细胞主要表达在PV区,由此引发的增殖驱动力是移植细胞从PV区指向性增殖并逐渐过渡到CV的因素。第3章移植细胞再生肝脏的机制探究目的:探究移植细胞再生肝脏的机制及肝细胞可塑性的调控机制方法:1.利用非负矩阵分解(NMF)识别细胞中的表达程序,并对不同的转录程序进行通路富集;2.将NMF识别得到的转录程序P1与AFP~+细胞转录组中正向相关基因取交集,利用取得交集后的基因集对group1和group2评分,并将异质性高的组别单独聚类分析,结合拟时序分析细胞亚群的发育轨迹;3.通过GSVA对不同样本进行氧化应激水平(reactive Oxidative Stress,ROS)评分,利用染色质可及性数据(ATAC-seq)联合分析关键转录因子。利用SCENIC鉴定细胞中的转录因子(transcription factors,TF)、并计算其活性,构建移植细胞潜在的基因调控网络(gene regulatory network,GRN)。结果:1.通过NMF识别所有样本的表达程序,可以得到两个稳定的转录程序P1和P2,分别对应AFP~+的去分化状态细胞和功能成熟的肝细胞;2.比较移植后不同时间点的移植细胞的表达水平。移植早期肝细胞ROS水平呈现上升趋势,移植中晚期ROS水平呈现下降趋势,并恢复至移植前水平。P53的靶标基因Trp53/p53、Cdkn1a/p16、Cyp2a4/5在3周样本中显著上调。细胞内抗氧化反应的关键转录因子Nfe2l2/Nrf2及其下游驱动抗氧化基因(Hmox-1/HO-1、GST)的表达上调;3.通过比较移植后不同时间点的脂质累积情况,移植后3周的细胞中脂质累积显著上升,脂肪酸合成基因(Fasn、Acly、Elovl5)、脂肪酸转运基因(Cd36、Fabp4)和脂肪酸氧化基因(Hadh)表达上调;4.通过对移植后3周样本进行独立评分,此阶段细胞整体呈现显著的异质性。通过对AFP~+细胞群体单独聚类分析,可以得到五个新的亚群C1-C5。结合拟时序分析,C3是这群AFP~+细胞的起始点;5.C3群体激活转录因子Nfe2l2/Nrf2,观察到下游的靶基因由过氧化物酶体增殖物激活受体家族(peroxisome proliferator-activated receptors,PPAR)调控,其中包括Cyp2a4/5、AFP;此外,C3也激活了Tbx3、Gata6、Foxa1干性相关的转录因子。TGF-β信号通路也在C3中富集,由此引发的上皮间质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)成为移植后早期肝细胞去分化的关键。结论:1.移植后早期部分肝细胞发生去分化表达AFP,同时该细胞群富集P53、购买Decitabine细胞周期、铁死亡信号通路;2.移植后早期肝细胞脂质累积增加、ROS水平显著上升,上调的P53通路参与保护肝脏功能并抑制铁死亡;其上游的Nrf2转录因子和下游的Cyp2a4/5上调以对抗氧化应激;3.由Hippo通路及其下游YAP/TAZ磷酸化状态介导的增殖表达上调成为移植后肝细胞去分化与增殖的关键