DuDu365生物天地

目的：基于毒痰瘀虚理论探讨中药复方对肝癌血管生成的影响。方法：制备Wistar大鼠含药血清，以含药血清体外培养HepG2细胞，并分为空白组、中药复方组（毒痰瘀脾肾虚方、毒痰瘀脾虚方、毒痰瘀肾虚方、毒痰瘀肾阳虚方、毒痰瘀肾阴虚方、毒痰瘀方）；采用酶联免疫吸附试验(Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)法检AM-2282 MW测细胞培养上清液中血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)表达；采用HepG2肝癌移植性肿瘤模型方法于小鼠腋下接种HepG2肝癌细胞株，免疫组织化学法检测肿瘤微血管密度（MVD）。结果：与空白组比较，中药复方LXH254纯度组可降低肝癌HepG2细胞中VEGF表达（P<0.01），其中毒痰瘀脾肾虚方（全方）组最明显。而除全方组外，其余各中药复方组对肝癌HStructuralization of medical reportepG2细胞中VEGF表达的影响作用相当，差异无统计学意义（P>0.05）。与空白组相比，中药复方组均能降低肝癌HepG2小鼠肿瘤组织中MVD，毒痰瘀脾肾虚方组最明显，差异具有统计学意义（P<0.05）；毒痰瘀组与毒痰瘀脾肾虚方组相比差异有统计学意义（P<0.05）。结论：基于毒痰瘀虚理论组方的中药复方具有抑制肝癌血管生成的作用。

海洋环境拥有着独特的生存策略,孕育的海洋生物具有极强的适应性和生物多样性,能产生各种结构独特的代谢产物,在药物合成及新药研究等领域发挥着重要的作用。近年来,从海洋生物中发现的新天然产物的数量越来越多,化合物结构上也具有较强的新颖性。尤其是海洋真菌,从海洋真菌中获得的次级代谢产物数量占总的新海洋天然产物数量的一半左右。而在海洋真菌体系内,海洋曲霉属真菌是新天然产物的主要来源,能产生多种类型的代谢产物,这些代谢产物大多具有较好的活性。南极环境更为严酷,更有可能产生结构新颖的代谢产物。本实验在课题组前BMS-907351期实验的基础上,对两株南极海洋曲霉属真菌进行了研究。以南极海洋曲霉属真菌Aspergillus sp.NJ49和Aspergillus sp.NJF3为研究对象,通过扩大其发酵体积,利用各种柱层析技术、半制备高效液相色谱技术对菌株Aspergillus sp.NJ49和Aspergillus sp.NJF3的发酵产物进行分离纯化,对于分离得到的化合物通过质谱、氢谱、碳谱和二维谱等多种现代分析技术手段进行结构鉴定。通过全基因组测序技术对Aspergillus sp.NJF3测序,预测次级代谢产物合成基因簇,并结合化学调控手段对菌株Aspergillus sp.NJF3进行调控。主要包括以下部分:1、南极海洋真菌Aspergillus sp.NJ49和Aspergillus sp.NJF3的次级代谢产物研究。通过对菌株AspergillusArsenic biotransformation genes sp.NJ49和Aspergillus sp.NJF3进行大规模发酵培养,利用多种硅胶柱、凝胶柱层析以及HPLC等对其分离纯化,结合多种波谱学方法对化合物的结构进行分析鉴定。在菌株Aspergillus sp.NJ49的代谢物中一共鉴定得到12个化合物,包括肽类化合物10个(1-10)、聚酮类1个(11)、芳香胺类化合物1个(12)。在菌株Aspergillus sp.NJF3代谢物中一共鉴定得到14个化合物,包括苯酰基衍生物1个(13)、聚酮类2个(14、22)、脂肪族化合物1个(15)、肽类化合物6个(6、16-20)、氨基酸衍生物1个(21)、嘌呤生物碱1个(23)、芳香胺类化合物2个(12、24),其中化合物13为新化合物。2、南极海洋真菌Aspergillus sp.NJF3的全基因组测序分析。对菌株Aspergillus sp.NJF3进行全基因组测序,利用Illumina和Pacbio平台进行二代、三代测序,通过分析得到整个基因组大小为38.00 Mb,GC含量为49.85%,组装得到28个scaffold。菌株Aspergillus sp.NJF3的基因组大小、GC含量、蛋白编码基因数量以及t RNA数量与其它曲霉属真菌接近。将预测得到的蛋白编码基因在多个数据库(NR、Egg NOg、KEGG、Swiss Prot和GO)进行注释,分别注释得到13220、12019、4258、9206和9053个基因。通过anti SMASH网站对Aspergillus sp.NJF3次级代谢产物生物合成基因簇进行分析,一共注释得到61个次级代谢产物合成基因簇,其中包括18个T1PKS型,7个NRPS-like型,5个萜类型,3个NRPS型,2个NRPS/T1PKS型,1个T3PKS型,1个T1PKS/NRPS型,1个吲哚类型和23个其CP-690550他类型的基因簇。然而目前从菌株Aspergillus sp.NJF3常规发酵提取物中分离鉴定的14个化合物及课题组前期分离得到的7个化合物均与基因簇预测结构信息存在差异。3、南极海洋真菌Aspergillus sp.NJF3的化学表观遗传调控。通过添加不同的蛋白翻译后修饰酶抑制剂—0.08μM OA、0.16μM OA和100μM SAHA,对菌株NJF3的次级代谢均有明显调控作用。通过对发酵物的产量、HPLC-DAD谱图及信号峰检测,在菌株Aspergillus sp.NJF3的培养时添加0.08μM OA,能极大丰富化合物的数量,增加次级代谢产物的结构多样性。本论文通过对两株南极海洋曲霉属真菌次级代谢产物的研究及其中一株曲霉属真菌进行全基因测序和化学表观遗传调控,印证了极地真菌次级代谢产物化学结构的多样性,丰富了极地天然产物的研究内容,为极地资源开发和利用提供了一定的理论基础。

目的 分析呼吸机相关性肺炎患者采用床旁纤维支气管镜肺泡灌洗联合抗生素治疗的效果以及对炎症指标的影响。方法 98例呼吸机相关性肺炎患者,根据随机单盲法分为对照组及观察组,每组49例。对照组采用常规药物治疗,观察组在对照组基础上采用床旁纤维支气管镜肺泡灌洗联合抗生素治疗。比较两组退热时间、机械通气时间、重症加强护理病房(ICU)治疗时间及治疗前后炎症指标(降钙素原、C反应DNA/RNA Synthesis抑制剂蛋白、白细胞介素-6)水平。结果 观察组退热时间(3.6±0.8)d、机械通气时间(9.BI 10773化学结构3±2.1)d、ICU治疗时间(13.2±4.3Sulfamerazine antibiotic)d短于对照组的(4.3±0.9)、(10.5±2.3)、(15.2±4.7)d,差异有统计学意义(P<0.05)。治疗前,两组降钙素原、C反应蛋白、白细胞介素-6炎水平对比,差异无统计学意义(P>0.05)；治疗后,观察组降钙素原、C反应蛋白、白细胞介素-6水平分别为(0.4±0.1)μg/L、(6.6±1.3)mg/L、(10.4±2.6)ng/L低于对照组的(0.6±0.3)μg/L、(12.5±2.5)mg/L、(15.2±3.2)ng/L,差异有统计学意义(P<0.05)。结论 床旁纤维支气管镜肺泡灌洗联合抗生素治疗呼吸机相关性肺炎的效果显著,对患者的炎症指标改善明显,具备优势。

目的 观察β-受体阻滞剂对瓣膜置换术后病人心脏功能、心脏结构及神经内分泌激素的影响。方法 选取2017年1月—2019年10月我院成功完成瓣膜置换术的病人100例，采用随机数字法分为对照组和观察组，各50例。对照组术后给予强心、利尿及血管紧张素转换酶抑制剂(ACEI)治疗，观察组在对照组基寻找更多础上联合β-受体阻滞剂治疗。比较两组术前、术后2周、4周、8周及16周心脏功能及结构指标[左房内径(LAD)、左室舒张末期内径(LVEDD)、左室射血分数(LVEF)]、神经内分泌激素[心房利钠肽(ANP)、血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)及醛固酮(ALD)]变化。结果 两组术前LAD、LVEDD、LVEF、ANP、AngⅡ及ALD比较，差异均无统计学意义(P>0.05);术后2周、4周、8周及16周，两组LAD、LVEDD、ANP、AngⅡ及ALD均低于术前(P<0.05或P<0.01),术后16周LVEF均高于术前(P<0.05);观察组术后4周PF-03084014、8周及16周LAD、ANP、AngⅡ均低于对照组(P<0.05或P<0.01);两组术后2周、4周、8周及16周LVEDDvector-borne infections、LVEF、ALD比较，差异无统计学意义(P>0.05)。结论 β-受体阻滞剂可促进瓣膜置换术后病人神经内分泌激素水平下降，改善心脏功能及心脏结构。

目的 探讨金莲花总黄酮对血管紧张素(Ang)Ⅱ诱导的心肌成纤维细胞(CFs)增殖、迁移的影响和潜在机制。方法 不同浓度(0.2、0.4、0.8 mmol/L)的金莲花总黄酮作用于AngⅡ诱导CFs。细胞计数试剂盒检测细胞活力确定金莲花总黄酮使用浓度。Transwell实验、实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测Angiogenesis抑制剂细胞迁移、miR-215-5p表达水平。Western印迹检测磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)和蛋白激酶B(AKT)的磷酸化水平。将miR-215-5p模拟物、抑制物分别转染CFs,检测上调或下调miR-215-5p对AngⅡ诱导的CFs增殖和迁移的影响。结果 金莲花总黄酮作用于AngⅡ诱导的CFs后，细胞活力、迁移能力、miR-215-5p、磷酸化(p)-PI3K和p-AKT蛋白表达显著降低(P<0.05)。上调miR-215-5p表达后，AngⅡ诱导的CFs活力、迁移能力显著升高(P<0.05)。下调miR-215-5p表达后，AngⅡ诱导的CFs活力、迁移能力显著降低(P<0.05)。上Ocular biomarkers调miR-215-5p表达能够显著降低金莲花总黄酮对AngⅡ诱导的CFs活力、迁移能力及PI3K/AKT信号通路的影响(P<0.05)。结论 金莲花总黄酮能够降低AngⅡ诱导的CFs增殖和迁移，其机制可能与下调miR-215-5p表达和抑制PDehydrogenase抑制剂I3K/AKT信号通路有关。

尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus)选择性自噬接头受体蛋白1 (sequestosome 1 receptor protein,Sqstm1)是一种选择性自噬接头蛋白，可选择性参与清除细胞内受损的细胞器和蛋白质。为分析sqstm1基因的功能，研究其在健康尼罗罗非鱼各组织中的表达分布及抗菌抗病毒应答过程中的表达模式，本研究克隆了On-sqstm1基因(GenBank No. XP＿005463852) ORF序列，通过生物信息学及亚细胞定位分析Onsqstm1基因的序列和定位特征，利用q PCR技术分析其在健康罗NLRP3抑制剂非鱼各组织及不同刺激物刺激后各组织中的表达模式，采用双荧光素酶报告系统检测On-sqstm1基因过表达对核因子κB (nuclear factor kappa-B,NF-κB)活性的影响。结果显示，本研究成功克隆了On-sqstm1基因的ORF序列，长度为1 287 bp，编码428个氨基酸；亚细胞定位结果显示On-Sqstm1蛋白定位于细胞质。qPCR结果显示On-sqstm1基因在罗非鱼各组织中均有表达，在肝脏中表达量最高；在无乳链球菌(SPLX-4720纯度treptococcus agalctiae)和Poly I:C病毒类似物刺激后，该基因在罗非鱼的脑、头肾、肝脏、肠道及脾脏组织中的表达量均显著上调(P<0.05)。双荧光素酶报告系统显示On-Sqstm1蛋白可Biolistic transformation以显著激活NF-κB活性。以上结果显示，On-Sqstm1蛋白可能通过介导NF-κB信号通路的活性参与对病原体感染的免疫应答过程。本研究为进一步研究On-Sqstm1蛋白的作用机制提供了参考。

生猪养殖是环境中抗生素耐药基因（antibiotic resistance genes,ARGs）的重要来源之一，而养猪废水的排放是ARGs进入环境的主要渠道。目前，养猪废水中ARGs排放所导致的环境效应尚不明晰，同时，不同养猪废水处理工艺对于ARGs去除的相关研究尚处于起始阶段，需要进行更加深入、细致的研究，以及探索减少养猪废水中ARGs丰度的养殖废水处理方法。本文综述了养猪场内ARGs从产生到进入环境的过程以及当前ARGs污染情况和研究现状，从不同的污水处理法（厌氧生物处理法、好氧生物处理法、物理化学法购买Elexacaftor、人工湿地法）出发，重点介绍养猪场污水处理工艺中mid-regional proadrenomedullinARGs的分布和去除效果，认为物理化学法是消减养猪废水中ARGs污染问题最具前景的处理方式。最后，基于目前养猪废水处理CX-5461抑制剂工艺在去除ARGs存在的不足，提出了优化处理工艺措施并强化各工艺间ARGs监测的可行性建议。

猪血凝性脑脊髓炎病毒(Porcine hemagglutinating encephalomyelitis virus;PHEV)属于β冠状病毒属的成员,是目前所知能够感染猪的六种冠状病毒之一。与同属的其他冠状病毒如SARS、MERS及SARS-Co V-2相似,PHEV也可感染猪的上呼吸道而表现出咳嗽、打喷嚏等流感样症状;与同属的其它几种冠状病毒不同的是,PHEV具有典型的神经嗜性,经呼吸道感染后,病毒沿外周神经向中枢神经系统(Central nervous system,CNS)传递,可引起明显的神经症状,呈现非化脓性脑炎和神经退行性病变特征,包括大脑皮质及海马神经元变性坏死、神经元轴突生长发育不良、树突棘形成不稳定以及神经突不规则膨胀和断开等。根据现有文献分析,PHEV感染后的神经入侵及神经损伤是导致宿主发病死亡的重要原因。为了进一步明确PHEV感染及致病的分子机制,本研究从PHEV感染与宿主细胞互作角度进行了系统深入地研究。临床上PHEV主要经呼吸道途径感染,因此本研究利用滴鼻方式接种PHEV模拟自然感染途径建立小鼠感染模型。接毒后6天内小鼠全部死亡,接毒第4天可观察到弓背、尖叫、后肢瘫痪及前肢抖动呈“弹钢琴样”等明显的神经症状。在小鼠体内,病毒主要分布于脑和脊髓,在外周组织中几乎检测不到病毒的存在,表明PHEV具有明显的嗜神经性。在脑组织内,PHEV阳性信号主要定位在神经元,表明神经元为PHEV感染的靶细胞。PHEV感染后引起脑组织明显的病理变化,包括“血管套”形成、神经元变性及丢失、胶质结节等非化脓性脑炎特征,同时可见不同脑区突触数目减少、形成突触的蛋白表达含量降低等神经退行性病变。感染小鼠的临床症状及神经病理变化与发病仔猪高度相似,表明小鼠可作为PHEV致神经损伤研究的理想动物模型。为了进一步阐明PHEV经呼吸道感染后入侵中枢神经系统的途径,首先对接毒小鼠的鼻黏膜及脑组织病毒分布情况进行检测。在感染24 h后即可在鼻黏膜观察到病毒的阳性信号,并且随着感染时间的延长,病毒感染的细胞数量逐渐增加;在脑组织内,感染后第3天,病毒主要分布在嗅球及嗅觉相关的大脑皮质、梨状叶;第5天病毒广泛分布在整个CNS。在感染小鼠的鼻黏膜嗅觉区域可见PHEV与嗅觉神经元共定位,同时病毒阳性信号沿着嗅神经分布,表明PHEV可通过嗅觉神经环路到达嗅球从而进入CNS。使用ZnSO_4和Triton X-100两种药物破坏鼻腔嗅觉神经末梢后可明显推迟小鼠死亡时间,但其对小鼠最终的死亡率及死亡小鼠脑组织病毒载量无显著影响,证明嗅神经可作为PHEV入侵的通路,而且可能存在其他的神经入侵通路。对药物处理后接毒小鼠脑组织的病毒分布情况进行检测,发现病毒抗原首先出现在脑干区域,随着感染时间延长,扩散到整个CNS。免疫荧光结果可见病毒抗原沿着三叉神经分布。以上结果表明,除嗅神经外,PHEV也可通过三叉神经到达脑干完成CNS入侵。在鼻腔内,PHEV主要分布在呼吸区和嗅区,PHEV感染导致呼吸区及嗅区黏膜上皮脱落并伴随炎性细胞浸润;在嗅球内,PHEV主要分布在帽状细胞层,病毒感染导致嗅球产生明显的炎症反应及神经元发育异常;行为学实验结果发现,PHEV感染可导致嗅觉味觉功能障碍。PHEV经外周的嗅神经和三叉神经进入CNS后主要感染神经元,然而,病毒感染过程中神经细胞自身的抗损伤效应是否发挥作用,还不明确。细胞的内质网(Endoplasmic reticulum;ER)可通过激活内质网应激(ER stress;ERS)发挥适应性调节,抵御外界刺激,维系细胞稳态。与其他细胞相比,神经元内含有更加丰富的内质网,即光镜下看到的尼氏体,本研究对神经元这种独特的结构在PHEV感染过Chlamydia infection程中发挥的作用进行了检测分析。研究发现,PHEV感染神经细胞后,在体内和体外均可活化ERS相关的标记分子,并不同程度地激活ERS下游相关的IRE1、PERK和ATF6三条信号通路,体内实验也可得到相同的结论。分别使用药物诱导及缓解ERS,结果发现ERS可负调控病毒复制。由于神经元损伤的不可逆性Decitabine小鼠,ERS介导的抗病毒反应对于降低神经损伤、维持CNS的稳态至关重要。为了筛选ERS发挥抑制病毒作用的通路,分别使用RNA干扰、特异性抑制剂处理及过表达等方法,证明PHEV感染激活的IRE1信号通路不参与PHEV的复制过程,而ATF6信号通路活化后可促进病毒复制,仅仅活化的PERK信号通路具有抑制该病毒复制的能力。深入研究证实,PERK的活化使真核翻译起始因子2α(Eukaryotic initiation factor 2α;e IF2α)发生磷酸化,进而发挥抗病毒作用。对其它几种e IF2α磷酸化激酶的检测结果显示,除PERK外,双链RNA依赖的蛋白激酶(PKR)也可使e IF2α磷酸化而发挥相似的功能。PSBE-β-CD作用ERK与PKR二者协同,共同抑制PHEV复制。最后,本研究对PERK/PKR-e IF2α信号通路发挥抗病毒作用的机制进行了探讨。研究表明,e IF2α作为翻译起始因子在蛋白质的翻译起始过程中起着重要的作用,e IF2α磷酸化可导致翻译起始受阻,从而引起蛋白合成停滞。首先,本研究检测了PHEV感染细胞的蛋白总体翻译水平,结果证明e IF2α磷酸化后可通过降低蛋白质总体翻译水平而实现对PHEV复制的抑制;同时,磷酸化的e IF2α也可促进应激颗粒的形成,药物处理诱导应激颗粒或过表达应激颗粒关键蛋白可明显抑制PHEV的复制。综上所述,经滴鼻方式接种PHEV后,病毒感染鼻腔内的嗅区和呼吸区黏膜,突破黏膜屏障的病毒粒子沿着嗅神经及三叉神经侵入CNS,引起嗅觉味觉等神经功能障碍;感染的神经元可激活ERS效应抑制病毒复制,这种抑制作用是通过PERK与PKR协同作用而使e IF2α发生磷酸化,进而通过减弱整体蛋白翻译水平和促进应激颗粒形成,实现对PHEV复制的抑制。该研究结果不仅明确了PHEV经呼吸道侵入CNS的路径,揭示了ERS在PHEV感染神经细胞过程中的作用,而且对于深入解析PHEV致病的分子机制、发现神经细胞ERS的新特性以及开发潜在抗神经损伤的药物靶标具有重要的参考价值。

探究西黄丸含药血清调控低氧诱导因子1α (hypoxia inducible factor-1α， HIF-1α)/血管内皮生长因子A (vascular endothelial growth factor A， VEGFA)/血管内皮生长因子受体2 (vascular endothelial growth factor receptor 2， VEGFR2) 信号通路， 抑制脑胶质瘤细胞血管生成拟态 (vasculogenic mimicry， VM) 形成的作用及机制。采用对雄性SD大鼠连续灌胃给药7天，制备西黄丸含药血清 (动物实验伦理审批号: 202105A051)。采用200 μmol·L~(-1) CoCl_(2)构建U251细胞低氧模型， 给予西黄丸含药血清后， CCK-8法、细胞克隆实验检测U251细胞活力和增殖情况; 流式细胞术检测U251细胞凋亡及周期; 细胞划痕愈合、Transwell侵袭实验检测U251细胞的迁移与侵袭能力; 3D细胞培养检测U251细胞VM的形成情况; Western blot法检测U251细胞HIF-1α、VEGFA、VEGFR2、磷酸化VEGFR2 (phosphoryselleck HPLClated-VEGFR2， p-VEGFR2)、血管内皮钙黏着蛋白 (vascular endothelial-cadherin， VE-cadherin)、Eph受体酪氨酸激酶A2 (Eph receptor tyrosine kinases A2， EphA2)、基质金属蛋白酶2 (matrix metalloproteinase 2， MMP2)、基质金属蛋白酶14 (matrix metalloproteinase 14， MMP14) 和层黏连蛋白γ2 (laminin γ2) 等蛋白表达水平。liver biopsy结果显示， 低氧状态下， 10%西黄丸含药血清对U251细胞活力、增殖、凋亡和细胞周期影响较小。与低氧模型组相比， 10% 1.0、1.5和2.0 h组西黄丸含药血清均显著减慢U251细胞的迁移速率 (P < 0.01)， 显著减少侵袭的U251细胞数量 (P < 0.01)。10% 2.0 h组西黄丸含药血清显著抑制低氧状态下U251细胞的VM管状结构形Pidnarulex体外成 (P < 0.01)。Western blot实验显示， 10%西黄丸含药血清显著下调HIF-1α、VEGFA、phospho-VEGFR2、VE-cadherin、EphA2、MMP14等蛋白表达 (P < 0.05)。综上所述， 西黄丸可通过下调HIF-1α/VEGFA/VEGFR2信号通路， 抑制脑胶质瘤U251细胞VM形成， 发挥抗血管生成的作用。

目的:本研究从125例健康婴儿粪便样本中分离鉴定出加氏乳杆菌(Lacselleck化学tobacillus gasseriPCI-32765细胞培养)并对其安全性和抑菌性能进行评价。方法:本研究以1月龄健康婴儿粪便样本为对象,经过MRS培养基分离纯化、革兰氏染色、生化bioactive packaging鉴定和16S rRNA测序技术进行菌种鉴定;随后,对分离得到的加氏乳杆菌利用血琼脂平板进行溶血性评价;利用微量肉汤稀释法对常见抗生素的药物敏性进行测定,并对加氏乳杆菌的安全性进行评价;最后,采用牛津杯法检测对大肠杆菌ATCC 25922和金黄色葡萄球菌ATCC 25923的抑制作用。结果:从125例健康婴儿粪便样本中成功分离并鉴定出15株加氏乳杆菌。溶血性检测结果显示,14株均无溶血性;待测菌株对四环素、万古霉素、利奈唑胺、利福平敏感性较高,对亚胺培南完全敏感,对甲氧苄啶完全耐药;抑菌实验结果显示,有6株菌同时对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌具有抑菌效果。结论:本研究从健康婴儿粪便样本中成功分离筛选出3株安全性较高且对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌同时具有一定抑制作用的加氏乳杆菌,编号分别为:LGI 6-1、LGI 6-2、LGI 6-3,作为潜在的益生菌资源,为后续深入探究加氏乳杆菌功能提供研究对象。