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为获取猪圆环病毒3型衣壳蛋白(PCV3-Cap蛋白),本试验参照PCV3 HBBD1810毒株(GenBank登录号：MK105924)的基因组序列信息合成cap基因，并将其克隆至原核表达载体pET-32a中，对重组质粒进行Pexidartinib供应商测序和双酶切鉴定后，将重组质粒转化Rosetta大肠杆菌，对最佳IPTG诱导浓度和诱导表达时间筛选，并对目的蛋白表达后的存在形式进行检测以及对纯化条件进行筛选，透析复性后利用鼠源抗PCV3-Cap单克隆抗体进行Western blot以验证目的蛋白的反应原性。结果显示，通过构建原核表达系统获得大小为42 kDa的PCV3-Cap蛋白；破菌处理后目的蛋白主要以包涵体形式存在于沉淀中；0.2 mmol/L IPTG 37℃下诱导培养8 h后蛋白表达量较高；在300 mmol/L咪唑洗脱时纯化出清晰条带；经过Western blbiologic medicineot验证目的蛋白能够被鼠源抗PCV3-Cap单克隆抗体识别，具有良好的反应原性。结果表明，本试验成功构建了PCV3-Cap蛋白表selleck HPLC达载体，成功表达PCV3-Cap蛋白，同时优化了表达和纯化条件，为PCV3亚单位疫苗的研制以及检测试剂盒的开发和研究提供了科学依据。

目的:建立稳定可靠的液相色谱串联质谱(LC-MS/MS)方法，检测雌激素雌酮(E_1)、雌二醇(E_2)及其代谢产物2-甲氧基雌酮(2-MeOE_1)、4-甲氧基雌酮(4-MeOE_1)、2-甲氧基雌二醇(2-MeOE_2)、4-甲氧基雌二醇(4-MeOE_2)、16α-羟基雌酮(16α-OHE_1)、2-羟基雌酮(2-OHE_1)、4-羟基雌酮(4-OHE_1)、2-羟基雌二醇(2-OHE_2)、4-羟基雌二醇(4-OHE_2)共11个目标分析物的浓度水平，观察乳腺癌患者血清雌激素稳态的变化规律。方法:利用丹磺酰氯作为衍生化试剂，对待测物进行衍生化处理，采用Agilent ZORBAX Extend-C_(18)色谱柱(100 mm×2.1 mm, 1.8μm),以含0.1%甲酸的乙腈溶液和含0.1%甲酸的水溶液为流动相，梯度洗脱，流速0.3 mL·min~(-1),柱温为25℃,进样量30μL。质谱采用ESI离子源，多反映监测(MRM)的正离子扫描方式进行定量检测雌激素及其代谢产物共11个目标分析物(E_1、E_2、2-MeOE_1、4-MeOE_1、2-MeOE_2、4-MeOE_2、16α-OHE_1、2-OHE_1、4-OHE_1、2-OHE_2和4-OHE_2)。从特异性、线性及范围、定量限、准确度和精密度、提取回收率、基质效应和稳定性等方面对建立的分析方法进行验证。用本法对41例乳腺癌患者和25例健康志愿者的血清样本进行雌激素及其代谢产物检测，比较2组间雌激素及其代谢产物的差异。结果:LC-MS/MS法可同时检测人血清中11个HCV infection目标分析物的浓度selleck抑制剂，在标准曲线范围内线性良好；批内和批间精密度<15%;准确度绝对值<15%;提取回收率均>85%;基质效应在85%～115%;稳定性良好。用本方法进行临床血清雌激素及其代谢产物检测，测得对照组中E_1、E_2及其代谢产物2-MeOE_1、4-MeOE_1、2-MeOE_2、4-MeOE_2、16α-OHE_1、2-OHE_1/4selleck产品-OHE_1、2-OHE_2、4-OHE_2的浓度分别为(0.101±0.006)(0.170±0.012)(1.078±0.104)(0.086±0.008)(0.064±0.000)(0.115±0.051)(0.071±0.006)(0.132±0.023)(0.237±0.020)和(0.225±0.027) nmol·L~(-1),乳腺癌患者组相应的11个目标分析物的浓度分别为(0.174±0.017)(0.335±0.041)(0.958±0.080)(0.072±0.006)(0.066±0.001)(0.065±0.023)(0.097±0.007)(0.183±0.020)(0.365±0.084)和(0.366±0.082) nmol·L~(-1),结果表明乳腺癌患者原型雌激素(E_1和E_2)和羟基化雌激素(16α-OHE_1,2-OHE_2,4-OHE_2和2/4-OHE_1)的浓度显著增加，而甲氧基化雌激素(4-MeOE_2)的浓度明显降低。结论:本实验建立的血清中雌激素(E_1和E_2)及其代谢产物(2-MeOE_1、4-MeOE_1、2-MeOE_2、4-MeOE_2、16α-OHE_1、2-OHE_1、4-OHE_1、2-OHE_2和4-OHE_2)的LC-MS/MS定量检测方法准确、快速、可靠，可作为乳腺癌患者血清雌激素及其代谢产物检测的参考方法。乳腺癌状态下，雌激素稳态失衡与乳腺癌的发生发展密切相关，雌激素可能作为乳腺癌发生发展的潜在疾病标志物。

目的 探讨JQ-1与小豆蔻明(CAR)联用对乳腺癌细胞MCF-7增殖和细胞凋亡的影响。方法 将MCF-7细胞实验分为空白组(不给药)、对照组(10Biolistic-mediated transformation.00μmol·L~(-1) CAR)、实验组(25.00μmol·L~(-1) JQ-1)及联合组(10.00μmol·L~(-1) CAR+25.00μmol·L~(-1) JQ-1)。4组细胞均培养48 h。用CCK-8法检测细胞的增殖能力，用Annexin-V FITC/PI双染法检测细胞的凋亡情况，用蛋白质印迹法检测磷酸化磷脂酰肌醇3激酶(p-PI3K)、磷酸化蛋白激酶B(p-AKT)和活化后胱天蛋白酶7(Cleaved Caspase7)的表达水平。结果 联合组、实验组、对照组和空白组的增殖率分别为(47.79±11.27)%、(66.75±26.56)%、(74.57±13.59)%和(100.00±0)%,细胞晚期凋亡率分别为(24.17±1.27)%、(7.07±0.80)%、(14.70±3.12)%和(4.98±2.98)%,p-PI3K蛋白相对表达水平分别为0.87±0.02、1.11±0.06、1.09±0.03和1.00±0.00,p-AKT蛋白相对表达水平分别为0.31±0.05、0.96±0.06、0.96±0.16和1.00±0.00,Cleaved Caspase7蛋GDC-0068研究购买白相对表达水平分别为2.70±0.04、1.51±0.03、1.2EPZ-6438核磁8±0.01和1.00±0.00。联合组的上述指标与空白组、对照组、实验组比较，差异均有统计学意义(P<0.05,P<0.01)。结论 JQ-1与CAR联用对乳腺癌细胞MCF-7具有增强抑制细胞增殖、促进细胞凋亡的作用，其作用机制可能与调控PI3K/AKT通路相关。

通过紫外光谱、荧光Brain-gut-microbiota axis光谱、共振散射光谱、圆二色谱、粘度实验、琼脂糖凝RP56976纯度胶电泳和荧光显微镜研究了多环芳烃类化合物萘(NAP)与DNA之间的作用机理。紫外光谱结果表明，NAP通过嵌入结合与DNA形成了稳定的PLX5622复合物。加入NAP后DNA的热熔温度增加了21.49℃,说明NAP的嵌入使DNA双螺旋结构的稳定性增加。粘度实验结果显示，随着NAP浓度的不断增加，DNA相对粘度逐渐增大，说明二者是通过嵌插方式发生相互作用。圆二色谱进一步证实NAP与DNA的作用模式是嵌入结合。荧光光谱结果表明，DNA能有效猝灭NAP的荧光，猝灭机制以静态猝灭过程为主，常温下结合常数和结合位点数分别是2.9×10~6 L/mol和1.32。根据共振散射光谱数据计算得到NAP与DNA的结合饱和值为2.5。通过结合过程的热力学参数表明，NAP与DNA之间的主要作用力为氢键和范德华力。琼脂糖凝胶电泳和荧光显微镜结果直观地揭示了NAP与DNA是以嵌入模式相结合。此外，基于NAP嵌入结合DNA的原理，利用DNA与磁珠选择性捕获NAP,其去除率为99.35%。该研究为建立基于多环芳烃(PAHs)-DNA相互作用清除PAHs的方法提供了新思路。

研究背景心血管疾病仍然是世界范围内的主要死亡原因,血管损伤引起的血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cell,VSMC)过度增殖和迁移,在冠心病、血管成形术后再狭窄以及肺动脉高压等多种心血管疾病的发病机制中发挥关键作用。VSMCs位于血管壁的中间层,是高度特化的细胞,负责调节血管张力,进而调节血液分布和压力。与大多数终末分化细胞不同,在生长因子、细胞因子、机械力以及其他损伤刺激下,VSMC可以在收缩(分化)表型和合成(去分化)表型之间转化,即VSMCs的表型转化(phenotypic switch)。其中,血小板衍生生长因子(platelet derived growth factor,PDGF)-BB主要由损伤部位的血管内皮细胞和血小板释放,能够调节多种转录因子和信号通路,促进损伤后VSMC增殖并向新生内膜层迁移,是目前研究最有效的VSMC表型转化刺激剂之一。然而,PDGF-BB作为VSMC表型开关的分子机制尚不明确。环状RNAs(circular RNAs,circ RNAs)是一类具有基因调控作用的非编码RNA,与传统线性RNA相比,circ RNA由外显子或内含子首尾相接而成,呈独特的封闭环状结构,耐受核酸外切酶降解,具有较长的半衰期。越来越多的证据表明circ RNAs在发育、衰老、癌症等生理病理过程中发挥重要的调控作用。既往报道的circ RNAs可作为微小RNAs(mi RNAs)分子海绵调控下游靶基因的表达,还可发挥蛋白支架、转录调控、竞争线性剪接以及多肽翻译等多种功能。近年来,circ RNAs在心血管疾病中的研究进展迅速,例如circ MAP3K5通过调节mi R-22-3p/TET2通路影响PDGFBB介导的平滑肌细胞分化;circ ITCH能够海绵mi R-330-5p并上调SIRT6、Survivin和SERCA2a表达,改善阿霉素诱导的心脏毒性。但目前为止,针对VSMC表型转化的circ RNA研究相对较少,且大多数circ RNAs都被认为是细胞质中的mi RNAs海绵,对于circ RNAs在转录后调控的作用尚不明确。因此,探索新的VSMC表型转化相关circ RNAs,全面揭示其下游调控机制,对动脉粥样硬化、肺高压等血管增殖性疾病具有重要的诊断和治疗价值。本课题中,我们利用高通量RNA测序对PDGF-BB刺激的人主动脉平滑肌细胞(human aortic smooth muscle cells,Ao SMCs)中差异表达的circ RNAs进行筛选,通过生物信息学分析及表达验证鉴定差异显著、序列保守的circ RNAs,并对其调控Ao SMC增殖、迁移以及表型转化的功能及机制进行深入研究。第一部分:环状RNA circ SATB2＿015的筛选和鉴定方法:1)建立PDGF-BB刺激的Ao SMC表型转化模型,进行去线性、去核糖体RNA(r RNA)的高通量测序,结合生物信息学筛选差异表达的circ RNAs,并对差异circ RNAs进行富集分析;2)通过q RT-PCR实验,对候选circ RNAs在PDGFBB、10%FBS诱导增殖模型以及SMDM分化模型中的表达进行验证;3)通过c DNA/g DNA实验、Sanger测序、放线菌素D实验以及RNase R消化实验,对目标circ RNA进行成环性验证;4)通过数据库检索(circ Base、circ Bank、UCSC)分析目标circ RNA的基因信息、保守性及翻译潜能;通过q RT-PCR明确目标circ RNA的表达丰度;5)通过核质RNA分提、RNA荧光原位杂交实验(FISH)明确目标circ RNA的胞内核质分布情况;6)通过HE染色、RNA荧光原位杂交(FISH)及免疫荧光(IF)实验,明确目标circ RNA在人冠心病血管组织中的表达情况。结果:1)通过高通量测序筛选,以P<0.05为过滤条件、Fold change=1.5为筛选标准,得到71条PDGF-BB刺激差异表达的circ RNAs(上调:40条,下调:31条),对差异circ RNAs进行聚类分析、保守性评估、宿主基因GO富集分析、KEGG以及Reactome信号通路分析筛选得到12条候选circ RNAs;2)QRT-PCR验证显示,相比其他候选circ RNAs,hsa＿circ＿0003915(hsa＿circ SATB2＿015)在PDGF-BB刺激模型中下调最为明显且重复性好,PDGF-BB、10%FBS均可引LBH589体内起hsa＿circ＿0003915的时间依赖性下调,而SMDM分化培养可引起hsa＿circ＿0003915时间依赖性上调;3)跨接头序列的反向引物(背靠背)在c DNA中扩增得到DNA片段,而在g DNA未检测到扩增产物,对扩增片段进行Sanger测序测到hsa＿circ＿0003915的接头序列,放线菌素D(actinomycin D)实验及RNase R消化实验显示hsa＿circ＿0003915相比线性RNA具备更长半衰期、能够耐受核酸外切酶的降解;4)Hsa＿circ＿0003915与mmu＿circ＿008822在序列上高度保守(93%),且存在开放阅读框(ORF)和内部核糖体进入位点(IRES)序列,hsa＿circ＿0003915在Ao SMC、HUVEC、PASMC等脉管细胞中显著高表达;5)核质RNA分提及RNA-FISH实验证明hsa＿circ＿0003915主要定位于胞浆(胞浆84.1%,胞核15.9%);6)组织样本RNA-FISH实验表明,hsa＿circ＿0003915(circ SATB2＿015)在冠心病患者冠脉组织中低表达。结论:通过对PDGF-BB刺激的Ao SMC表型转化模型进行去线性、去r RNA的高通量测序,结合生物信息学、细胞模型表达验证、成环性验证及分子特征鉴定,筛选得到一条在PDGF-BB刺激细胞模型、动脉粥样硬化血管组织中显著下调的circ RNA,命名为circ SATB2＿015,该circ RNA由2q33.1染色体上SATB2基因(NM＿001172509.2)的4-7外显子环状剪接而成,全长为531bp,胞浆富集,序列在人和小鼠中高度保守。第二部分:Circ SATB2＿015调节血管平滑肌细胞增殖、迁移及分化,改善内膜增生方法:1)设计合成circ SATB2＿015的si RNA及过表达腺病毒,转染Ao SMCs,在细胞水平构建circ SATB2＿015的敲减和过表达模型,q RT-PCR实验验证敲减、过表达效率;2)通过Beyo Click TM Ed U-594检测circ SATB2＿015敲减或过表达对Ao SMCs增殖能力的影响;3)通过划痕愈合实验检测circ SATB2＿015敲减或过表达对Ao SMCs水平迁移能力的影响;4)通过Transwell迁移实验检测circ SATB2＿015敲减或过表达对Ao SMCs垂直迁移能力的影响;5)通过q RT-PCR、免疫印迹实验(western blot),检测circ SATB2＿015敲减或过表达对Ao SMCs分化标志物表达水平的影响;6)建立小鼠颈动脉导丝损伤模型,损伤处灌注circ SATB2＿015过表达腺病毒或对照病毒,通过HE染色评估circ SATB2＿015对导丝损伤后血管内膜增生的影响。结果:1)Circ SATB2＿015-si RNA-1敲减效果可靠,可将circ SATB2＿015表达下调至0.1以下,circ SATB2＿015腺病毒滴度为100 MOI时,circ SATB2＿015的表达水平可升至90倍,且si RNA及过表达腺病毒均不影响宿主SATB2的表达;2)Beyo Click TM Ed U-594检测显示,敲减或过表达circ SATB2＿015可以分别促进或抑制Ao SMCs的增殖活性;3)划痕愈合实验表明,敲减或过表达circ SATB2＿015可以分别促进或抑制Ao SMCs的水平迁移能力;4)Transwell迁移实验表明,敲减或过表达circ SATB2＿015可以分别促进或抑制Ao SMCs的垂直迁移能力;5)QRT-PCR、western blot实验结果表明,敲减或过表达circ SATB2＿015能够抑制或促进Ao SMCs中α-平滑肌肌动蛋白(ACTA2)、钙调蛋白1(CNN1)和肌动蛋白相关蛋白22-α(SM22-α,TAGLN)的表达;6)灌注circ SATB2＿015过表达腺病毒能够显著抑制小鼠颈动脉导丝损伤后VSMCs的表型转化,缓解内膜增生。结论:通过转染si RNA和过表达腺病毒,在Ao SMCs中敲减、过表达circ SATB2＿015,结果表明circ SATB2＿015能够抑制Ao SMC增殖、迁移,促进Ao SMCs向分化表型转化;动物水平上,circ SATB2＿015过表达能够显著抑制小鼠颈动脉导丝损伤后VSMCs的表型转化,改善内膜增生。第三部分:Circ SATB2＿015通过调控mi R-9-5p/myocardin通路促进血管平滑肌细胞分化方法:1)通过mi Randa软件预测mi RBase数据库中可能与circ SATB2＿015结合的mi RNAs,并使用加尾法、茎环法设计mi RNAs引物;2)QRT-PCR验证目标mi RNA在增殖、分化模型中的表达;3)QRT-PCR验证敲减或过表达circ SATB2＿015对目标mi RNA的表达调控;4)Circ RNA-mi RNA FISH共定位确定circ SATB2＿015与目标mi RNA的结合关系;5)通过RNA结合蛋白免疫沉淀实验(RIP)实验明确Ago2蛋白能否结合circ SATB2＿015及目标mi RNA;6)设计合成针对circ SATB2＿015反向剪接位点的生物素标记RNA探针,通过RNA-RNA pull-down实验证明circ SATB2＿015与目标mi RNA直接结合;7)设计合成目标mi RNA的mimic及inhibitor,q RT-PCR验证过表达、敲减效率;8)设计合成circ SATB2＿015野生型、突变型双荧光素酶报告基因质粒,通过双荧光素酶报告基因实验进一步验证circ SATB2＿015与目标mi RNA的结合位点;9)通过Beyo Click TM Ed U-594检测目标mi RNA mimic及inhibitor对Ao SMC增殖的影响;10)通过划痕愈合实验检测目标mi RNA mimic及inhibitor对Ao SMC迁移的影响;11)通过q RT-PCR、western blot,检测目标mi RNA对Ao SMCs分化标志物表达水平的影响;12)通过mi RPath B、Targetscan以及mi Rwallk网站预测目标mi RNA下游的靶基因;13)通过q RT-PCR、western blot检测mi RNA对下游靶基因的表达调控作用;14)设计合成含靶基因3’UTR结合序列的野生型、突变型双荧光素酶报告基因质粒,通过双荧光素酶报告基因实验验证mi RNA与下游靶基因的结合关系;15)通过q RT-PCR、western blot实验检测circ SATB2＿015对靶基因的表达调控作用。结果:1)Mi Randa软件预测提示circ SATB2＿015与hsa-mi R-9-5p有两个结合位点,序列在人、小鼠中保守;2)PDGF-BB可引起mi R-9-5p时间依赖性上调,而SMDM分化培养可引起mi R-9-5p时间依赖性下调;3)敲减或过表达circ SATB2＿015能够分别促进或抑制Ao SMCs中mi R-9-5p的表达;4)Circ RNA-mi RNA FISH共定位实验显示circ SATB2＿015与mi R-9-5p在Ao SMCs中共定位于胞浆;5)RIP实验显示,相比Ig G组,circ SATB2＿015和mi R-9-5p在Ago2抗体组显著富集;6)RNARNA pull-down实验表明,相比阴性探针组,circ SATB2＿015和mi R-9-5p在circ SATB2＿015生物素探针组均显著富集;7)转染mi R-9-5p的mimic及inhibitor能够明显提高或降低Ao SMCs中mi R-9-5p的表达水平;8)双荧光素酶报告基因实验显示,mi R-9-5p能够与circ SATB2＿015上两处结合位点结合;9)Beyo Click TM Ed U-594检测显示,mi R-9-5p的mimic或inhibitor可以分别促进或抑制Ao SMCs的增殖活性;10)划痕愈合实验表明,mi R-9-5p的mimic或ihibitor可以分别促进或抑制Ao SMCs的水平迁移能力;11)QRT-PCR、western blot实验结果表明,mi R-9-5p能够抑制Ao SMCs中分化标记物(ACTA2、CNN1和TAGLN)的表达;12)Mi RPath B、Targetscan以及mi Rwallk预测发现心肌素(myocardin,MYOCD)可能为mi R-9-5p下游靶基因,q RT-PCR、western blot实验结果表明,mi R-9-5p能够负向调控Ao SMCs中MYOCD的表达;13)双荧光素酶报告基因实验表明,mi R-9-5p可以直接与MYOCD的3’UTR结合(位点1,1756-1763;位点2,5225-5231);14)QRTPCR、western blot实验结果表明,敲减或过表达circ SATB2＿015能够分别抑制或促进Ao SMCs中MYOCD的表达。结论:1)RIP、RNA pull down以及双荧光素酶报告基因实验表明,circ SATB2＿015能够吸附mi R-9-5p并负向调控其表达;2)Mi R-9-5p mimic、inhibitor转染Ao SMCs后的功能实验表明,mi R-9-5p能够促进Ao SMC增殖、迁移,抑制Ao SMCs向分化表型转化;3)Mi R-9-5p能够靶向分化基因MYOCDBioconcentration factor的3’UTR区,阻断其m RNA及蛋白表达。Circ SATB2＿015通过海绵机制负向调控mi R-9-5p的表达,从而解除mi R-9-5p对靶基因MYOCQ-VD-Oph体外D的抑制作用,促进Ao SMCs向分化表型转化。第四部分:Circ SATB2＿015通过抑制YBX1的SUMO化修饰阻断CDK1的转录激活,从而抑制血管平滑肌细胞增殖方法:1)设计合成针对circ SATB2＿015反向剪接位点的生物素标记RNA探针,通过RNA-蛋白pull-down实验、银染及蛋白质谱分析,探索circ SATB2＿015直接结合的蛋白,并进行功能富集分析;2)通过Cat RAPID、RBPmap网站预测circ SATB2＿015与YBX1的结合位点;3)QRT-PCR、western Blot检测PDGF-BB、circ SATB2＿015对Ao SMCs中YBX1 RNA及蛋白水平的表达调控;4)通过放线菌酮(CHX)、MG132处理评估circ SATB2＿015对YBX1稳定性及泛素化降解的影响;5)通过Uni Prot网站探索YBX1的表观修饰类型,SUMO sp 2.0.预测YBX1的SUMOylation位点,通过Cat RAPID网站预测circ SATB2＿015与SUMO2的结合位点;6)通过western blot检测circ SATB2＿015对Ao SMCs中SUMO2蛋白水平的影响;7)通过western blot检测circ SATB2＿015 pull down产物中YBX1及SUMO2蛋白的富集情况;8)通过RIP实验,检测YBX1及SUMO2抗体拉下的RNA产物中是否存在circ SATB2＿015富集;9)通过RNA FISH及IF实验,明确circ SATB2＿015与YBX1的胞内定位;10)Pairwise Structure Alignment软件预测YBX1与SUMO2结合的空间构象,蛋白免疫共沉淀(CO-IP)验证YBX1与SUMO2蛋白的直接结合;11)通过MG132处理评估SUMO2对YBX1稳定性及泛素化降解的影响;12)通过蛋白核质分提实验检测circ SATB2＿015对YBX1、SUMO2核质分布的影响;13)使用Jaspar网站预测YBX1与CDK1启动子区的结合位点;14)设计合成YBX1 si RNA及过表达质粒,并评估其对CDK1 RNA及蛋白水平的表达调控;15)通过q RT-PCR、western blot检测circ SATB2＿015对CDK1的表达调控作用。结果:1)RNA-蛋白pull down的蛋白银染结果显示,相比阴性探针组,circ SATB2＿015生物素探针组在多个蛋白条带处存在特异性富集,通过蛋白质谱及GO、KEGG分析发现,circ SATB2＿015结合蛋白在RNA binding、protein binding等分子功能富集;2)Cat RAPID、RBPmap网站预测显示,circ SATB2＿015在100-400nt与YBX1的结合能力最强;3)PDGF-BB、circ SATB2＿015不影响YBX1的m RNA水平,但YBX1在PDGF-BB刺激下蛋白水平呈时间依赖性升高,circ SATB2＿015敲减或过表达可增高或降低YBX1的蛋白水平;4)CHX抑制蛋白合成后,敲减circ SATB2＿015能够引起Ao SMCs中YBX1蛋白降解减慢,半衰期延长,circ SATB2＿015过表达引起的YBX1蛋白水平下调可以被MG132处理所阻断;5)SUMO sp 2.0.软件预测发现YBX1存在SUMOylation位点,Uni Prot网站预测YBX1存在SUMO2修饰位点,Cat RAPID软件预测显示circ SATB2＿015能够结合SUMO2蛋白,在100-300 nt二者结合能力最强;6)Circ SATB2＿015过表达或敲减不影响SUMO2的蛋白水平;7)通过western blot检测circ SATB2＿015的pull down产物,发现YBX1及SUMO2蛋白均明显富集;8)RIP实验结果表明,YBX1、SUMO2抗体拉下的RNA产物中均有circ SATB2＿015富集;9)RNA FISH及免疫荧光实验表明,circ SATB2＿015与YBX1蛋白在Ao SMCs胞浆共定位;10)CO-IP结果显示YBX1-IP组YBX1、SUMO2蛋白均明显富集,表明二者可直接结合;11)通过western blot实验证实SUMO2 si RNA敲减效果明显,SUMO2敲减后YBX1的蛋白水平明显下调,而MG132处理能够逆转这种下调;12)对Ao SMCs进行蛋白核质分提,western blot实验结果表明,敲减circ SATB2＿015后,胞浆及胞核YBX1蛋白水平均升高,而SUMO2蛋白在胞浆分布增多,在胞核分布减少;13)Jaspar预测网站显示,YBX1与CDK1的启动子区(正义链)有4个可能的结合位点;14)QRT-PCR及western blot显示Ao SMCs转染YBX1的si RNA、过表达质粒能够显著抑制或促进CDK1的表达;15)QRT-PCR、western blot实验结果表明,敲减或过表达circ SATB2＿015能够分别促进或抑制Ao SMCs中CDK1的表达。结论:1)Circ SATB2＿015能够同时结合YBX1、SUMO2形成复合体,抑制SUMO2修饰对YBX1的稳定作用,促进其泛素化降解;2)YBX1在细胞核可结合到CDK1的启动子区,激活其转录活性;3)Circ SATB2＿015通过蛋白支架作用抑制YBX1的SUMO化修饰,阻断下游CDK1的转录激活,发挥对Ao SMCs的增殖抑制作用。

目的 了解内蒙古自治区艾滋病哨点吸毒人群（DUs)HIV、梅毒、HCV感染状况和高危行为发生情况以及变化趋势。方法 采用重复横断面调查方法，2016-2021年每年4-6月在监管场所连续抽样，对抽到的DUs进VX-765体外行一对一问卷调查和血清学检测。结果 2016-2021年，DUs中使用传统毒品的比例为63.38%～87.71%，且呈上升趋势（χ_(趋势)~2=45.967,P<0.001）。最近1年有商业性性行为capsule biosynthesis gene的占比从2016年的11.71%上升到2021年的22.78%，其中每次都使用安全套的占比从54.17%下降到36.09%，差异均有统计学意义（χ_(趋势)~2=22.475；χ_(趋势)~2=32.053;P均<0.001）。selleck产品曾经注射吸毒的占比从2016年的19.80%下降到2021年的16.84%，其中共用针具的占比从2016年的40.81%下降到12.06%，差异均有统计学意义（χ_(趋势)~2=74.984；χ_(趋势)~2=66.537;P均<0.001）。HIV抗体阳性率在0～0.15%之间。梅毒抗体阳性率在1.80%～5.43%之间，呈上升趋势；HCV抗体阳性率在20.91%～30.26%之间，呈下降趋势；差异均有统计学意义（χ_(趋势)~2=7.326,P=0.007；χ_(趋势)~2=25.215,P均<0.001）。结论 内蒙古自治区哨点监测DUs以使用传统毒品为主，HIV抗体阳性率较低，HCV、梅毒抗体阳性率处于中等水平；高危行为依然存在，继续有效深入地进行干预是今后工作的重点。

目的 探讨来源于树突状细胞购买Enasidenib（DCs）的外泌体对人脐静脉内皮细胞（HUVEC）炎症因子的作用和机制。方法 从C57BL/6J小鼠中分离获得骨髓树突状细胞（BMDCs）并培养，采用超速离心法分别从BMDCs及经脂多糖（LPS）诱导成熟的BMDCs培养基中分离获得外泌体、并经电镜扫描及免疫印迹法（WB）验证；构建CD63-GFP慢病毒载体并转染BMDCs细胞，Transwell共培养BMDCs细胞与HUVEC、并用外泌体处理细胞；应用ELISA法检测各组细胞肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白介素-6(IL-6)的浓度，蛋白质印迹法（Western blot）测试p100和p105的磷酸化水平，实时荧光定量聚合酶链式反应（RT-PCR）测试TNF-α和IL-6的mRNA表达水平，利用免疫荧光技术检测HUVEC摄取外泌体的情况。结果 激光共聚焦显微镜观察显示，HUVEC能摄取BMDCs来源的外泌体；通过LPS诱导的成熟和未成熟的BMDCs外泌体中的IL和TNF水平无统计学差异；BMDCs与HUVEC共同培养的培养基中IL-6和TNF-α的浓度和p100和p105的磷酸化水平比单纯培养HUVEC培养基中的表达明显升高（P<0.05），但BMDCBrain infections外泌体被外泌体抑制剂GW4869抑制后，TNF-α和IL-6含量及p100和p105的磷酸化水平明显下降（P<0.01）；共培养联合NF-κB抑制剂BAY11-7082组中的TNF-α和IL-6含量及p100和p105磷酸化水平比单纯HUVEC与BMDCs共培养组明显下降（P<0.001）。结论 BMVP-16体内实验剂量DCs来源的外泌体能够被HUVEC摄取，并促进HUVEC炎症因子TNF-α和IL-6升高，其机制可能与BMDCs来源的外泌体影响NF-κB信号通路中p100以及p105的磷酸化水平有关。

畜禽粪便是储存和传播抗生素抗性基因(ARGs)的主要载体.为明确鸡粪和猪粪堆肥过程中ARGs和MGEs相对丰度的变化及影响其消减的关键环境因子，探索减少畜禽粪便堆肥中ARGs含量并降低其污染风险的有效方法，采用实时荧光定量PCR技术和16S rRNA高通量测序技术，测定了鸡粪和猪粪好氧堆肥75 d的过程中，不同阶段10种ARGs和7种可移动遗传元件(MGEs)的丰度变化和细菌群落变化，分析了ARGs和MGEs与细菌群落的相关性和堆体理化性质(温度、含水率、 pH和DOC)变化对ARGs和MGEs丰度的影响.结果表明，猪粪(PM)中ARGs和MGEs丰度显著高于鸡粪(CM).堆肥结束后，两种堆肥中9种ARGs和5种MGEs的相对丰度均显著降低，其中CM中3种ARGs(tetM、tetT和aacA)和4种MGEs(ISEcp1、IS1216、IS613和tnp614)的去除率达到99%; PM中9种ARGs[tetB(P)、tetL、tetM、tetO、tetT、aacA、aadD、aphA3和sat4]及4种MGEs(ISEcp1、IS26、IS1216和tnp614)去除率均达到99%;而两种堆体中的tetG、intI1和IS6100相对丰度均呈增长趋势.厚壁菌门(Firmicutes)和放线菌门(Actinobacteria)是堆肥中的主要细菌类群，相关性分析结果表明放线菌门和变形菌门(Proteobacteria)可能是tetG和intI1的潜在宿主，它们在堆肥后期丰度增加可能是导致这2种基因丰度增加的原因.冗余分析(RDA)表Tofacitinib化学结构明，含水率和pH是影响CM和PM堆肥过程中ARGs和MGEs相对丰度变化的关键环境因子，堆肥理化性质、细菌群落和MGEs共同驱动了ARGs的组成和丰度变化.堆肥可显著降低鸡粪和猪粪中ARGs的丰度Tamoxifen，pathologic outcomes从而降低畜禽粪便在农业生产中ARGs扩散的风险；但仍有部分ARGs和MGEs高丰度残留，因此需进一步优化堆肥工艺，提高畜禽粪便的无害化处理效果，促进有机肥安全农用.

本研究旨在克隆牦牛微管相关蛋白1轻链3B（microtubule associated protein 1 light chainBiocompatible composite 3B， LC3B）基因，制备牦牛LC3B多克隆抗体，为探究自噬在牦牛生殖生理过程中的作用奠定基础。通过基因克隆方法获得牦牛LC3BMS-907351 IC50B基因序列，利用原核表达、亲和层析法纯化牦牛LC3B重组蛋白，使用纯化的蛋白为抗原免疫10月龄日本大耳白兔，SephaSCH772984浓度rose4B柱层析法纯化制备牦牛LC3B多克隆抗体，利用酶联免疫吸附测定（ELISA）测定抗体效价，并使用蛋白质免疫印迹（WB）、免疫组织化学法（IHC）和免疫荧光技术（IF）检测牦牛生殖器官中LC3B蛋白的表达。结果显示，本研究成功克隆出牦牛LC3B基因（登录号：OP572227），构建的重组质粒pET-32a-LC3B能够诱导产生重组蛋白，并且在包涵体和上清中均有表达；所纯化出的牦牛LC3B重组蛋白大小为34 kDa（含Trx和His标签），符合预期结果。通过免疫日本大耳兔后得到的兔抗牦牛LC3B蛋白血清，抗体效价分别为1:640 000和1:320 000，特异性良好，表明牦牛LC3B蛋白多克隆抗体制备成功。纯化后的抗体应用于牦牛生殖器官中LC3B的表达检测，LC3B在牦牛卵巢、输卵管和子宫中表达，并且能识别LC3B-I和发生脂化后的LC3B-II，主要表达于细胞质及细胞核周。本研究通过成功克隆牦牛LC3B基因制备了牦牛LC3B多克隆抗体，使用抗体检测发现LC3B蛋白在牦牛生殖器官中均有表达，表明所制备的多克隆抗体特异性良好，能够应用于牦牛LC3B蛋白的检测和细胞自噬水平的研究。

目的 探讨黄芪多糖对成骨细胞分化的影响及相关机制。方法 选取6只体重15～30 g的1周龄SPF级SD大鼠（雌雄各半）的颅骨提取成骨细胞，将细胞分为对照组及黄芪多糖低、中、高剂量组，分别给予0、0.006 1、0.012 2、0.022 4 g/L的黄芪多糖进行干预培养，48 h后进行碱性磷酸酶、茜素红染色。向细胞转染自AZD2281价格噬荧光标记病毒，将转染成功的细胞分为对照转染组及黄芪多糖低、中、高剂量转染组，给予相应浓度的黄芪多糖干预培养，24 h后在荧光显微镜下观察荧光强度。使用自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤（3-MA）(10 mmol/L)与黄芪多糖共同干预成骨细胞，分为3-MA组、3-MA+黄芪多糖低剂量组、3-MA+黄芪多糖中剂量组、3-MA+黄芪多糖高剂量组，通过PCR检测抑制自噬前后黄芪多糖对成骨分化标记基因表达的影响。结果 黄芪多糖低、中、高剂量组茜素红染色矿化面积比例及碱性磷酸酶活性均高于对照组，且黄芪多糖中、高剂量组高于黄芪多糖低剂量组，黄芪多糖高剂量组高于黄芪多糖中剂量组（P<0.05）。黄芪多糖低、中、高剂量转染组荧光强度均高于对照转染组，且黄芪多糖中、高剂量转染组高于黄芪多糖低剂量转染组，黄芪多糖高剂量转染组高于黄芪多糖中剂量转染组（P<0.05）。黄芪多糖低、中、高剂量组Runt相关转录因子2(RUNX2)、骨唾液酸蛋白（BSP）、骨钙素（OCN）、Ⅰ型胶原蛋白A1(COL1A1)基因表达均高于对照组，且黄芪多糖中、高剂量组高于黄芪多糖低剂量组，黄芪多糖高剂量组高于黄芪多糖中剂量组（P<0.05）。对照组、3-MA组、3-MA+黄芪多糖低剂量组、3-MA+黄芪多糖中剂量组、3-MA+黄芪多糖高剂量组RUNX2、BSP、OCN、COL1A1基因表达比较，差异无统计学意GDC-0973说明书义（P>0.hepatic transcriptome05）。结论 黄芪多糖可通过提高细胞自噬水平促进成骨细胞分化。