DuDu365生物天地

目的：本文旨在通过网络药理学及体外实验验证，探讨人参-甘草治疗非小细胞肺癌（NSCLC）的潜在机制及初步药效作用。方法：首先利用中药系统药理学数据库与分析平台（TCMSP）筛选出人参-甘草的活性成分和潜在靶点。通过数据库TTD（Therapeutic Target Database）、CTD（Comparative Toxicogenomics Database）和Gene Cards（The Human Gene Database）获得NSCLC的靶点，进而获取疾病-药selleck抑制剂物的交集靶点。利用数据库Shepatic abscessTRING和Cytoscape软件建立蛋白相互作用网络（PPI）。通过基因本体（GO）分析和京都基因与基因组百科全书（KEGG）富集分析确定人参-甘草治疗NSCLC的主要通路与关键靶点。最后利用MTT比色法及流式细胞术验证人参-甘草抗肿瘤作用。结果：通过TTD、CTD和Gene Ca点击此处rds筛选，得到人参-甘草作用于NSCLC的交集靶点122个。从STRING数据库构建的PPI网络中可以得出，其中的苏氨酸蛋白激酶（AKT1）、细胞性肿瘤抗体P53（TP53）、半胱天冬酶3（CASP3）、血管内皮生长因子A（VEGFA）可能成为治疗NSCLC的关键靶点。通过PPI、GO和KEGG综合分析，确定人参-甘草作用NSCLC的关键靶点为AKT1、TP53、IL、AMPK、TNF。体外实验结果显示人参-甘草能显著抑制人非小细胞肺癌细胞增殖，并能诱导肿瘤细胞凋亡，从而发挥抗肿瘤作用。结论：本研究初步探讨了人参-甘草活性成分对NSCLC的潜在机制及初步药效作用，为临床上应用人参-甘草治疗非小细胞肺癌提供新的理论依据。

目的 探讨来氟米特(LEF)在免疫球蛋白G4相关性疾病(IgG4-RD)诱导缓解及维持治疗中的有效性及安全性。方法 回顾性纳入已随访12个月的活动期IgG4-RLY-188011体内实验剂量D病人，以糖皮质激素(GC)联合LEF治疗者(LEF组)为病例组，匹配起始治疗时年龄、性别组成、病程、受累器官数、IgG4-RD反应指数(RI)及相关实验室指标后，以仅使用GC治疗者(单药组)及使用GC联合其他免疫抑制剂治疗者(其他组)为对照组。分析所有研究对象在0、1、3、6和12个月时的RI,3、6和12个月时的疾病缓解率，12个月的累积复发率及累积GC剂量等。结果研究共纳入84例病人，其中LEF组15例、单药组23例、其他组46例。3组病人在12个月时RI的下降程度均>50%;在3、6、12个月时，LEF组的RI均优于单药组(F=4.288～7.020,P<0.05),但与其他组无明显差别(P>0.05)。LEF组在6、12个月时的缓解率(66.7%和86.7%)均显著高于单药组(17.4%和43.5%)(χ~2=9.474、7.088,P<0.05),与其他组(52.2%和76.1%)相比差异均无显著性(P>0.05)。LEF组12个月的累积复发率低于单药组(χ~2=4.799,P<0.05),累积GC剂量也低于单药组(H=15.993,P<0.01),但与其他组比较差异均无显著性(P>0.05)。LEF组在3、6、12个月时的GC剂量低于单药组和其他更多组(F=4.001～4.708,P<0.05)。所有病人均未发生严重不良事件。结论 在IgG4-RD的诱导缓解和维持治疗Autoimmune haemolytic anaemia阶段，LEF与GC联合治疗效果优于GC单药治疗，有效性、安全性与GC联合其他免疫抑制剂治疗相似，但GC用量更少。

由苹果黑腐皮壳Valsa mali(Vm)引起的腐烂病(Apple Valsa canker)造成苹果树皮溃烂坏死、树势衰弱、果品下降,严重时导致树死园毁,是苹果生产中最具毁灭性的病害。近几十年来,尽管国内外在该病原生物学研究中取得了一系列进展,然而对于其关键致病因子仍缺乏深入认识。鉴于该病菌能够引起树皮腐烂坏死,推测毒素及毒素蛋白在其侵染过程中发挥关键作用。目前为止,国内外已从Vm中陆续分离、鉴定到一些小分子毒素物质,但尚无任何致病相关毒素蛋白的报道。Nep1(Necrosis and ethylene-inducing peptide 1)-Like Protein(NLP)是广泛存在于细菌、真菌和卵菌中的一类毒素蛋白,其能够诱导双子叶植物细胞坏死,是多种植物病原菌中的重要致病因子。为此,本研究对Vm的NLP蛋白进行了分析、鉴定,并对其生物学功能进行研究。获得的主要结果如下:(1)Vm编码两个NLP蛋白(Vm NLP1和Vm NLP2),其中Vm NLP2能够诱导植物细胞坏死本研究以最早发现于尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)中的Fo Nep1为基本序列,利用BLAST＿P从Vm基因组中鉴定到两个NLP蛋白,分别命名为Vm NLP1和Vm NLP2。在本氏烟(Nicotiana benthamiana)中瞬时表达发现,Vm NLP2能够诱发细胞坏死,而Vm NLP1不能诱导坏死。进一步经原核表达获得Vm NLP2纯化蛋白并滴加至苹果(Malus domestica)叶片发现,该蛋白也能诱导苹果细胞坏死。NLP蛋白存在高度保守的七肽基序(GHRHDWE),然而Vm NLP2七肽基序中的第二个组氨酸突变为了酪氨酸(GHRYDWE)。将该酪氨酸替换为保守组氨酸(Vm NLP2~(Y137H))后,其在本氏烟上诱导的细胞坏死较Vm NLP2增强。以上结果表明Vm NLP2是一个具有诱导细胞坏死的毒素蛋白,且其七肽基序中酪氨酸位点影响毒素活性。(2)Vm NLP2是一个重要致病因子为明确Vm NLP1和Vm NLP2是否参与病菌致病,本研究利用PEG介导的遗传转化体系分别获得两个基因的敲除突变体并接种至苹果叶片和枝条进行致病力测定。结果发现,与野生型(WT)相比,Vm NLP1敲除突变体致病力无明显变化,而Vm NLP2敲除突变体ΔVm NLP2-36在苹果叶片和枝条上的致病力分别下降了约16%和27%。为探究Vm NLP2致病力与其诱导坏死活性的可能关系,将Vm NLP2~(Y137H)点突变序列回补至ΔVm NLP2-36并进行致病力检测,发现该回补突变体在叶片上的致病力较Vm NLP2回补菌株增强约18%。该部分结果说明Vm NLP2是Vm的一个重要致病因子,且其坏死活性有利于病菌侵染致病。(3)Vm NLP1和Vm NLP2参与维持细胞膜稳定性及对盐和渗透胁迫的响应为进探究Vm NLP1和Vm NLP2是否参与Vm对非生物胁迫的响应,将其敲除突变体分别接种至含有不同抑制剂的PDA平板上并观察菌落生长情况。结果发现,与WT相比,Vm NLP1及Vm NLP2敲除突变体在含SDS、刚果红和山梨醇的平板上营养生长受到不同程度的抑制或促进作用,表明Vm NLP1和Vm NLP2在维持Vm细胞膜完整性,以及在病菌对盐胁迫和渗透胁迫的响应中发挥不同的作用。(4)Vm NLP2中的保守selleckchem Mirdametinib多肽能够被非寄主拟南芥识别研究表明,NLP蛋白中的保守多肽可被拟南芥(Arabidopsis thaliana)识别并激发免疫反应。为探究Vm NLP1和Vm NLP2中相应保守多肽是否具有免疫诱抗性,本研究合成获得多肽nlp20(Vm NLP1)和nlp25(Vm NLP2)。用1μM多肽处理拟南芥叶片并对免疫反应相关指标进行检测发现,只有nlp25(Vm NLP2)能显著激发活性氧迸发以及免疫标志基因(At PR1、At WRKY33、At FRK1)的上调表达,并显著诱导拟南芥对核盘菌(ScleroC59溶解度tinia scmedical simulationlerotiorum)的抗性。然而,nlp25(Vm NLP2)不能诱导苹果活性氧迸发及免疫标志基因表达。该结果说明Vm NLP2中的保守多肽能够被拟南芥识别,但是不能被寄主苹果识别。综上所述,本研究从Vm中鉴定到Vm NLP1和Vm NLP2两个NLP蛋白,并揭示了Vm NLP2是一个毒素蛋白和腐烂病菌的重要致病因子。此外,分析了Vm NLP1和Vm NLP2调控腐烂病菌响应多种非生物胁迫的功能,探索到Vm NLP2保守多肽在拟南芥上的免疫诱抗功能。本研究为NLP蛋白功能多样性提供了证据,更重要的是,Vm NLP2作为一个重要致病因子可作为苹果树腐烂病防治中的一个潜在靶标,从而为靶向药剂的研发提供科学依据。

目的：基于缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)/血管内皮生长因子A(VEGFA)信号通路探讨柴胡桂枝汤对三阴性乳腺癌（TNBC）细胞的影响。方法：建立TNBC移植瘤模型，随机分为模型组，卡培他滨组（0.2 mg·kg-1），柴胡桂枝汤低、中、高剂量组（10.62、21.23、42.46 g·kg-1），每组10只，干预21 d。给药结束后，酶联免疫吸附测定法（ELISA）检测血清中肿瘤坏死因子-α(TNF-α)水平；实时荧光定量聚合酶链式反应（Real-time PCR）检测肿瘤组织中HIF-1α mRNA表达情况；免疫组化法（IHC）CoQ biosynthesis检测肿瘤组织中HIF-1α、TNF-α、VEGFA的表达水平及CD34染色检测肿瘤内血管生成情况并计算微血管密度（MVD）；蛋白免疫印迹法（Western blot）检测肿瘤组织中HIF-1α、VEGFA、表皮生长因子受体（EGFR）蛋白的表达。结果：与模型组比较，卡培他滨组、柴胡桂枝汤低、中、高剂量组TNF-α水平显著降低（P<0.Liraglutide体外01）,HIF-1α mRNA显著降低（P<0.01）,HIF-1α、TNF-α、VEGFA和CD34阳性细胞表达及MVD明显降低（P<0.05,P<0.01）,HIF-1α、VEGFA、EGFR蛋白水平显著降低（P<0.01）。与卡培他滨组比较，柴胡桂枝汤中、高剂量组TNF-α水平显著降低（P<0.01）,HIF-1α mRNA显著降低（P<0.01）,HIF-1α、TNF-selleck化学α和VEGFA阳性细胞表达显著降低（P<0.01）,CD34表达及MVD显著降低（P<0.01）,HIF-1α、VEGFA、EGFR蛋白水平均显著降低（P<0.01）。结论：柴胡桂枝汤可能通过调控HIF-1α/VEGFA信号通路，抑制TNBC细胞血管生成，从而发挥抗肿瘤作用。

裸甲藻亚胺毒素(Gymnodimines,GYMs)属于环亚胺类毒素(Cyclic imines,CIs),是一种由甲藻产生、广泛分布的海洋生物毒素。GYMs毒性强,有“快速作用”特征,可通过食物链或气溶胶进入生物体,对人类健康和水产养殖造成巨大危害。目前已开发的检测方法有小鼠生物法、液相色谱串联质谱法和受体结合法等,这些方法费用昂贵、操作复杂、特异性低,急需一种特异、灵敏、高效的检测方法。核酸适配体是一种新型的分子识别元件,被称为“化学抗体”。它是一种能与靶标特异性结合的单链寡核苷酸,通过指数富集的配体系统进化(Systematic evolution of ligands by exponential enrichment,SELEX)技术筛选,有特异性好、稳定性高、易于合成、便于修饰和免疫原性低等优点。目前尚没有GYMs适配体的报道。常规的适配体筛选采用固定靶标的策略,然而GYMs是脂溶性分子,不带电荷、分子量小、化学基团数量有限,缺少固定所需基团,难以固定,筛选其适配体具有一定挑战性。本课题采用固定文库、而非固定毒素的捕获SELEX(Capture-SELEX)来筛选裸甲藻亚胺毒素A(Gymnodimine-A,GYM-A)适配体,并对适配体进行鉴定、优化,通过分子结构预测、分子对接和分子动力学模拟,探讨适配体与GYM-A结合的结构基础,同时借助灵敏、快速、高通量、低成本的生物膜干涉技术(Biolayer interferometry,BLI),研制基于适配体的生物传感器,获得如下主要结果。首先,采用捕获SELEX筛选获得了GYM-A的适配体CSF-1R抑制剂。从随机合成的库容约10~(15)的初始ss DNA文库开始筛选,每一轮包括文库固定、靶标孵育、PCR扩增和单链制备四个步骤。筛选进程中,用微囊藻毒素LR(microcystin-LR,MC-LR)作为反筛靶标。监测每一轮ss DNA的回收率,经过12轮筛选,回收率不再提升时,将该轮富集的ss DNA进行克隆测序,得到的序列用Clustal X 2.1软件进行聚类分析,分成了6个家族。用mfold软件预测序列的二级结构和吉布斯自由能,合成每个家族中相似性较高或吉布斯自由能最低的序列作为候选适配体,经BLI技术测定与毒素的亲和力,获得K_D值最低(K_D=288 n M)的适配体G48。对G48进行截短优化,得到了与毒素亲和力提高了约两倍的适配体G48nop(K_D=95.30 n M)。圆二色谱法分析G48nop,发现波谱在216 nm和273 nm处有正峰,245 nm处有负峰,提示G48nop的二级结构中含有平行Baf-A1研究购买型G-四联体和B型双链DNA两种结构。加入GYM-A后光谱发生偏移,证明GYM-A与G48nop结合。BLI分析中,G48nop与其它10种有代表性的海洋生物毒素没有亲和力,与仅含有GYM-A或混合毒素中含有GYM-A的样品有亲和力,证明G48nop的特异性良好。微量热泳动分析中,G48nop与GYM-A结合的K_D为34.50±1.72 n M,与其它4种有代表性的海洋生物毒素无亲和力或低亲和力,进一步验证了G48nop与GYM-A有良好的结合亲和力和特异性。其次,表征了GYM-A与适配体G48nop结合的结构基础,推断了GYM-A与G48nop可能的结合模式。运用QGRS mapper在线软件、3D-Nus网站、RNA composer网站、Discovery studio 4.5软件、Py MOL 2.52软件和NAMD 2.10软件,构建了九种以G-四联体为基础的G48nop三维结构模型。Gromacs 5.1.4分子动力学模拟显示平行型G-四联体在10 ns内变化最小、结构最稳定,提示G48nop形成了以平行型G-四联体为基础的三维结构,命名为Q3,其由两层环状平面通过π-π堆积叠加而成,每层环状平面内的4个鸟嘌呤通过Hoogsteen氢键连接。运用Ox DNA2.4软件、Discovery studio 4.5软件和Gromacs 5.1.4软件,构建了一种含有发夹结构的G48nop三维结Prosthetic joint infection构,命名为H1,H1由环和茎两部分组成,茎部有9对碱基通过氢键形成稳定碱基对。采用Auto Dock 4.2软件和Auto Dock Vina 1.2.0软件,将Q3和H1分别与GYM同类物进行分子对接、结合能计算,结果显示:GYM-A可通过12个CH…π键结合在Q3顶部的凹槽,也可通过2个氢键和7个CH…π键结合在H1茎部的空腔处;Q3、H1与GYM-A的结合能ΔG分别为-9.5 kcal/mol和-12.1kcal/mol,结合能均较低,而H1的结合能更低,说明GYM-A与H1结合时更稳定;GYM-B、GYM-C分别与Q3或H1的结合能均比GYM-A高,说明Q3或H1均可特异地结合GYM-A。Gromacs 5.1.4分子动力学模拟表明100 ns中,Q3的均方根偏差(Root mean square deviation,RMSD)波动程度大于H1,Q3与GYM-A形成复合物的RMSD波动程度大于H1形成的复合物,说明H1单体更稳定,H1与GYM-A形成的复合物更稳定,这进一步验证了分子对接结果的可靠性。因此,GYM-A结合在H1的茎部,且这种结合方式更为稳定。最后,基于BLI技术,研制了检测GYM-A的适配体生物传感器。BLI技术检测步骤设置为定基线、适配体耦联、再次定基线、结合和解离。参考国际协调会议的标准来表征传感器的性能和可行性。表征内容包括线性范围、检出限、定量限、特异性、精密度、重复性和准确性等。检测GYM-A的适配体传感器,其线性范围为55—875 n M,检出限为6.21 n M,定量限为20.72 n M,灵敏度高。与四大类海洋生物毒素中的代表性毒素均无交叉反应,可在多种毒素存在的复杂环境中检测到GYM-A,特异性好。组间和组内的相对标准偏差为0.34—4.57%,精密度高。每个传感器可重复使用至少20次,重复性好。实际样品检测中回收率为96.65—109.67%,回收率较高,准确度好。综上所述,本研究在国内外首次筛选获得了与GYM-A具有高亲和力和强特异性的适配体G48nop,分子计算揭示了G48nop与GYM-A结合时可能形成发夹型三维结构,并研制了性能良好的基于该适配体的生物传感器。研究成果为缺少固定所需基团的小分子提供了适配体筛选的成功案例,为探究小分子与适配体特异结合提供了研究思路,为进一步推动适配体传感器在海洋生物毒素检测中的应用提供了技术储备。

目的 本研究旨在构建靶向肿瘤蛋白p53结合蛋白2(TP53BP2)基因的短发夹RNA(shRNA)慢病毒载体，以抑制肝癌细胞TP53BP2的表达。方法 设计了2对针对TP53BP2基因的RNA干扰序列，并合成相应的shRNA序列。shRNA退火形成双链oligo序列后，应用基因重组技术构建重组质粒，经菌落PCR和测序鉴定，将重组正确的质粒进行慢病毒包装和滴度测定，并采用Western Blot、qRT-PCR和激光共聚焦技术观察慢病毒Lenti-shTP53BP2对HepG2细胞TP53BP2基因的干扰效果。结果 测序比对结果显示，各重组慢病毒载体与设计参考序列一致，提示各重组慢病毒体构建成功；重组慢病毒载体经慢病毒包装后，显示pHS-ASR-LW429、pHS-ASR-LW512和pHS-ASR-LW513的滴度分别为9.7×10~8 TU/mL、6.1×10~8 TU/mL和6.4×10~8 TU/mL;用慢病毒Lenti-shTP53BP2(pHS-ASR-LW512和pHS-ASR-LW513)感染HepG2细胞后，与对照慢病毒(pHS-ASR-LW429)比，经Western Blot、qRT-PCR和激光共聚焦结果显示两个Lentigenetic carrier screening-shTP53BP2均能显著下调HepG2细Galunisertib纯度胞TP53BP2基因水平和蛋白表达量。结论 本研究成功构建了靶向TP53BP2基因shRNA慢病毒载体，其能有效下调HepG2细胞TP53BP2的表达，为进一步研究TP53BP2在肝癌发生发展过程中的LXH254 NMR机制研究奠定了基础。

针对目前奶味香基成本高、蛋白源种类与含量不足、风味单一、产香周期长等缺点,本课题以大豆分离蛋白(SPI)部分替代稀奶油,以两种不同酶法与发酵法相结合,制备得到两款兼具浓厚发酵香气和干酪风味的新型奶味香基。通过分析两款香基的风味差异及原因,选定两步酶法结合发酵法为制备稀奶油-SPI香基的最佳方法;同时通过菌酶不同处理针对该香基的主要代谢物Polyclonal hyperimmune globulin和关键挥发性风味物质进行系统分析,探究菌、酶对香基风味形成的不同作用;最后将两步法获得的香基以不同浓度梯度加入面包中,探究其对面包品质的影响,以期为开发更具成本效益、健康益处和风味价值的奶味香基提供新的思路。分别以一步酶法结合发酵(同一阶段在稀奶油-SPI底物中同时加入乳酸菌、蛋白酶和脂肪酶)和两步酶法结合发酵(在稀奶油-SPI底物中先加入乳酸菌和蛋白酶,该阶段结束后再加入脂肪酶)制备得到两款稀奶油-SPI香基,对两款香基的风味差异及原因进行系统的研究。总体来说,两步酶法结合发酵法是制备新型稀奶油-SPI复合风味香基的最佳方法。两步酶法结合发酵能够更好地促进干酪乳杆菌(Lactobacillus casei LC1)的生长,p H值更低(5.21),PF-02341066可滴定酸度更高(2.15(乳酸,%)),并拥有更高含量的乳酸(6.18 mg/g)、苹果酸(1.06 mg/gE-616452化学结构)和丁二酸(5.05 mg/g),蛋白降解也更为完全,多肽和游离氨基酸得到积累,同时短链挥发性羧酸以及3-羟基-2-丁酮、苯甲醛、糠醛、δ-十二内酯等重要挥发性风味物质的含量也较高,香基也因此拥有更强的发酵香味和酸味属性,并获得更高的总体感官评价;而一步酶法结合发酵制备的香基中乙酸(1.59 mg/g)和柠檬酸(1.23 mg/g)含量更高,游离脂肪酸和中长链挥发性酸的含量也较高,这导致其刺激性酸败味更为明显。选定两步酶法结合发酵法为最佳方法,跳过该方法完整制备工艺中一个或多个过程来制备菌酶不同处理组,研究L.casei LC1、蛋白酶和脂肪酶对该法制备得到的香基中主要代谢物和挥发性风味物质的影响,以及对香基特征性风味形成的作用。L.casei LC1可以消耗代谢柠檬酸以及丝氨酸、甘氨酸、甲硫氨酸和异亮氨酸,能够促进乳酸、乙酸、多肽、小肽和短链游离脂肪酸的积累;蛋白酶能够促进大分子量的肽以及少部分的多肽和小肽的生成,精氨酸、丙氨酸、缬氨酸、赖氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸的积累;脂肪酶能够促进游离脂肪酸的生成,特异性代谢消耗组氨酸、色氨酸;蛋白酶和L.casei LC1共同作用时能促进游离氨基酸的释放以及L.casei LC1代谢增殖,从而促进关键挥发性风味物质苯甲醛、乙酸、3-羟基-2-丁酮、2,3-丁二酮、糠醛和2-戊基呋喃的产生;而先用蛋白酶再用脂肪酶处理,有利于关键挥发性风味物质丁酸、己酸、辛酸、癸酸、9-癸烯酸、十二酸、辛酸乙酯和δ-十二内酯的积累,以及促进醛、甲基酮和醇代谢转化成关键酯类和挥发性酸。将两步酶法结合发酵制备的香基以及空白奶油以不同梯度加入面包中,研究香基和空白奶油对面包品质的影响。与空白奶油相比,较少含量的稀奶油-SPI香基就能显著改变面包中挥发物的组成比例,香基的最低添加量组(2%JP+L)能将挥发物中醇类、醛类、酸类、酮类、酯类、杂环类和其他类的比例由对照组的65.33%、18.20%、0.44%、5.87%、6.32%、2.94%、0.91%调整为50.76%、11.81%、12.73%、4.66%、16.66%、2.72%、0.66%,而空白奶油最高添加量组(8%C)仅将挥发物比例变为67.60%、13.94%、0.19%、8.07%、6.11%、3.22%、0.86%。稀奶油-SPI香基和空白奶油都能促进面包比容增大,硬度下降,以及酵母产气量的提高,并随着添加量的上升效果越发显著。其中,稀奶油-SPI香基的效果更为明显,香基的最高添加量组(8%JP+L)其面包比容和酵母产气量分别由对照组的3.52 m L/g和2075 m L提高至4.19 m L/g和2306 m L,而硬度由对照组的336 g降低至172 g。稀奶油-SPI香基和空白奶油对面包色泽皆无显著性影响,但都在一定程度上减弱面团持气性。随着添加量的提高,空白奶油面团的G’和G”均呈现出先上升后下降的趋势,tanδ变化不大;而稀奶油-SPI香基面团的G’、G”和tanδ则先上升后下降再上升,这可能是由于后者香基中的SPI和面筋蛋白建立起新的交联结构,改善面团流变性。相较于空白奶油,香基能够更为显著地改善面包品质。

目的:CircRNAs与肿瘤的发生发展有着密切的关系,然而,circRNAs在获悉更多胃癌的诊断和进展中的确切作用机制尚不完全清楚。本研究旨在挖掘胃癌患者circRNA数据库中差异明显的hsa＿circ＿0007991(circ7991)分子,建立定量的检测方法,明确与胃癌患者的临床病理资料特征相关性,为胃癌的诊断与预后判断提供新的生物标志物;深入研究circ7991在胃癌恶性进展过程中确切作用及调控机制,为胃癌的治疗提供新的靶点。方法:1.应用GEO生物数据库中胃癌患者组织circRNA和患者血浆circRNA的芯片数据结果进行相关信息学分析,筛选出在胃癌组织中异常表达的circRNAs。应用定量逆转录聚合酶链反应(q RT-PCR)验证在胃癌组织中差异低表达的hsa＿circ＿0007991(circ7991)。核质分离后q RT-PCR及RNA荧光原位杂交(RNAFISH)检测circ7991分子在胃癌细胞中的表达分布,对circ7991进行表征分析和统计学评估其表达水平与胃癌患者临床病理学特征之间的相关性。2.构建过表达circ7991的质粒以及敲减circ7991的小干扰RNA,在胃癌细胞株中通过实时荧光定量PCR方法检测circ7991过表达和敲减后的表达效率,采用生长曲线、克隆形成、Transwell实验来测定circ7991对胃癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力的影响;流式细胞术(FCM)检测方法分析circ7991对胃癌细胞系凋亡和周期的影响;在BALB/c裸鼠皮下和腹腔注射胃癌细胞建立皮下成瘤以及胃癌转移模型,以此判断circ7chronic otitis media991在体内对胃癌细胞的增殖和转移能力的作用。采用免疫组化(IHC)方法测定相关分子指标在肿瘤组织中的表达情况。3.采用TRAP实验、质谱分析(MS)结合免疫共沉淀实验(Co-IP)筛选出与circ7991结合的目标蛋白分子。RNA免疫沉淀实验验证circ7991与结合蛋白δ-catenin之间的相互作用。Western blot检测δ-catenin蛋白在胃癌肿瘤组织中的表达,使用蛋白酶体抑制剂MG132和蛋白合成抑制剂放线菌酮CHX预处理过表达circ7991的胃癌细胞,Western blot和泛素化实验检测δ-catenin蛋白表达水平、半衰期以及泛素化水平的影响。利用免疫共沉淀和MS筛选鉴定TRIM25与circ7991/δ-catenin之间的相互作用。4.采用Circbank、Circ Interactome、mi RDB和Star Base V2.0等多个生物信息学软件预测与circ7991可能结合的miRNA目标分子。构建circ7991双荧光素酶报告基因的载体,合成可能结合的miRNA mimics,通过荧光素酶报告基因技术筛选出目标miRNA。构建与miRNA具体结合位点突变的circ7991报告基因的相关载体,进一步检测确认circ7991与可能结合的miRNA的结合位点区域。把circ7991过表达质粒和可能结合的miRNA mimics一起转染到胃癌细胞株之后,采用生长曲线、克隆形成MLN4924分子量和Transwell实验研究两者之间是否存在相互作用及胃癌细胞功能的改变。5.通过RNA测序和多个生物信息学分析预测对miRNA可能作用的靶基因,通过对RNA测序富集分析circ7991可能参与的信号通路,运用双荧光素酶报告基因实验、Western blot实验以及细胞学相关实验进一步研究分析miRNA对目标基因的靶向作用。结果:1.GEO数据库中选取了在癌组织中差异低表达的circRNA分子,根据分子表征以及在胃癌组织、细胞中的表达情况最终确定circ7991作为我们后续的研究对象。Circ7991在胃癌组织、血清中呈低表达水平,生存曲线分析结果显示胃癌患者中高表达的circ7991有较好的总体生存。Circ7991由亲本基因EIF4G3的第3-5号外显子的线性转录本通过反向剪切拼接而成。RNA-FISH和核质分离实验结果显示circ7991在细胞质和细胞核都有分布。2.生长曲线、平板克隆形成、Transwell实验结果显示在胃癌细胞中circ7991的高表达能够抑制胃癌细胞的增殖、迁移和侵袭,FCM结果显示过表达circ7991后促进胃癌细胞的凋亡。体内动物实验模型中过表达circ7991能够缩小皮下肿瘤体积。3.TRAP实验、MS结合RIP实验筛选鉴定circ7991和候选蛋白δ-catenin能够特异性的结合,利用RIP反向验证了胃癌细胞circ7991和δ-catenin的结合。过表达circ7991不影响δ-catenin mRNA的表达,但会降低δ-catenin蛋白的表达水平,同时MG132和CHX实验提示circ7991可能通过抑制δ-catenin蛋白的泛素化水平进而介导δ-catenin的降解。Co-IP实验结合质谱技术筛选鉴定TRIM25在δ-catenin的泛素化降解中发挥关键性作用的E3连接酶。4.RNA结合蛋白免疫沉淀的相关实验结果表明,circ7991能够结合RISC复合体的关键成分即AGO2蛋白。通过多个生物信息学分析和双荧光素酶实验报告基因证实circ7991与mi R-4449之间存在结合位点。细胞回补实验显示mi R-4449 mimics可以部分逆转circ7991过表达对胃癌细胞的抑制作用。5.Circ7991过表达测序结果中参与β-catenin通路的相关基因,结合生物信息学预测的靶基因,结果表明SIK1可能受mi R-4449调控。双荧光素酶报告基因结果证实mi R-4449和SIK1之间存在结合位点。在胃癌组织中circ7991和SIK1的表达呈正相关关系。细胞增殖和Transwell实验显示下调SIK1的表达后能够部分回补由circ7991过表达所导致的胃癌抑制作用。结论:Circ7991在胃癌中低表达与胃癌患者的预后差密切相关;体内外实验结果表明过表达circ7991能够抑制胃癌细胞的增殖、迁移和侵袭;其分子机制为:(1)circ7991通过E3泛素连接酶TRIM25特异性结合δ-catenin蛋白并促进其泛素化和降解;(2)circ7991可作为mi R-4449的分子海绵上调SIK1的表达,导致β-catenin通路失活进而影响肿瘤的进展。我们的研究表明,在胃癌的诊疗中,circ7991具有新的诊断与预后标志物和治疗靶点的潜能。

目的 研究白虎加人参汤联合胰岛素强化治疗糖尿病酮症酸中毒对血气指标及氧化应激的影响。方法 将73例急诊糖尿病酮症酸中毒(DKA)患者按照随机对照实验原则均分为观察组38例(白虎加人参汤联合胰岛素治疗)和对照组35例(单纯胰岛素治疗),比较两组治疗效果、血气指标、氧化应激指标以及中医证候积分。结果 治Ceralasertib核磁疗后，两组临床有效率分别为92.11%(35/38)和74.29%(26/35),差异存在统计学意义(P<0.05);两组pH值、碳酸氢根(HCO_3~-)、剩余碱的水平均显著高于治疗前(P<0.05),且观察组升高幅度大于对照组(P<0.05);两组患者血气指标中的超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、过氧化氢酶(CAT)、总抗氧化能力(TAC)的含量均比治疗前高，MDA的含量比治疗前低；且观察组患者血气指标中的SOD、GSH-Px、CAT、TAC的含量均比对照组高，MDA的含量显著低于对照组(P<0.05);两组患者的中医临床证候积分都相较于治疗前有所降低(P<0.05),观察组低于对照组(P<0.05)。结论 给予急诊DKA患者白虎加人参汤联合胰岛素治疗能够早intramammary infection期有效控制病情，促进血气指标恢复，能够selleckchem显著提升临床疗效，改善临床证候，具有推广价值。

探讨7味药食同源中药水提取物及其联用对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、白色念珠菌的体外抑菌效果，并将其应用于抑菌喷雾剂。采用水提法提取药液，用纸片扩散法测得单药最低抑菌浓度（Minimum Inhibitory Concentration，MIC）及waning and boosting of immunity最小杀菌浓度(Minimal Bactericidal CBelumosudil供应商oncentration，MBC)，同时以“棋盘法+中药互配”筛选对上述致病菌具有较强协同抑制作用的药物组合，并确定适宜的药物配伍制备抑菌喷雾剂。结果显示，7味药食同源中药对3种供试病原菌均具有不同程度的抑菌效果，五味子、金银花、牡丹皮、肉桂、白芍和山楂的抑菌作用较强，其对大肠杆菌的抑菌圈直径达到12.5～26.5 mm，最低抑菌浓度（MIC）＜250.00 mg/mL，最小杀菌浓度（MBC）＜500.00 mg/mL；其中，五味子的抑菌作用最显著，对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、白色念珠菌的MIC分别为31.25 mg/mL、15.62 mg/mL、250.00 mg/mL。互配试验结果表明，10种不同的药物组合对3种供试菌的联合抑菌作用各不相同，牡丹皮和肉桂的配伍组合对大肠杆菌以及肉桂和五味子的配伍组合对金黄色葡萄球菌联合抑菌指数（fractional inhibitory concentration index，FICI）≤0.50，表现为协同作用，其中肉桂和白芍、牡丹皮和白芍的配伍组合对致病菌也有协同或相加作用。因此，选择牡丹皮、肉桂、五味子、白芍4味药食同源中药制备抑菌喷雾剂。同Antineoplastic and I抑制剂时初步确定药食同源中药抑菌喷雾制剂的制备工艺流程为在40℃水浴中，向中药提取液中依次搅拌加入0.2%苯甲酸、1.0%吐温-80和5.0% 1，2-丙二醇。多种药食同源中药具有抗菌作用，且其合理的配伍可以产生协同增效的效果，为无毒副作用抗菌喷雾的开发奠定了基础。