DuDu365生物天地

目的 观察艾司西酞普兰治疗系统性红斑狼疮患者的效果，分析其对患者不良心理状态及睡眠质量的影响。方法 纳入2019年3月～2021年3月期间我院收治的89例系统性selleckchem Q-VD-Oph红斑狼疮患者作为观medical consumables察对象，掷币法将其分为2组，两组患者均给予基础对症治疗，对照组44例给予心理治疗，观察组45例在对照组基础上接受艾司西酞普兰口服治疗，比较两组患者血清神经递质水平、焦虑、抑郁情绪以及睡眠质量。结果 治疗后，观察组患者汉密尔顿焦虑量表（HAMA）评分、汉密尔顿抑郁量表（HAMD）评分以及匹兹堡睡眠质量指数量表（PSQI）评分均明显低于对照组（P<0.05）；观察组患者去甲肾上腺素（NE）、5-羟色胺（Trichostatin A体外5-HT）以及神经肽（NPY）水平均明显高于对照组（P<0.05）。结论 艾司西酞普兰联合心理治疗能显著改善系统性红斑狼疮患者不良心理状态，缓解其焦虑、抑郁情绪，同时还利于睡眠质量的提高，值得临床推荐。

植介入医疗器械相关感染是现代临床医学的一大挑战,对人类健康造成毁灭性威胁。细菌是造成感染的主要病原体之一,特别是多药耐药细菌造成的危害更高,甚至可以危及患者生命。细菌在医疗器械表面黏附是发生医疗器械相关感染的先决条件,因此对其表面进行抗菌修饰具有重要的意义。然而,传统的释放型、接触型和抗污型抗菌表面存在生物相容性低、作用时效短、影响人体组织整合等问题,可能影响医疗器械自身的治疗功能。针对上述问题,本论文以天然聚合物为基础,面向不同医疗器械的具体需求,通过合理调控selleck成膜液中成膜组分、交联组分和抗菌组分的比例,引入对细菌微酸环境具有响应性的席夫碱结构以交联各个组分,提出采用挥发成膜的方法在不同种类的医疗器械表面构建抗菌涂层。通过便捷的挥发成膜一步修饰法,在骨科内固定材料表面构建稳定的长效自适应抗菌涂层,用于骨折固定后感染的治疗。通过对成膜液的交联组分的调控,在导尿管内外表面构建具有良好抗菌、抗污和润滑性能的涂层,应用于尿路感染的治疗。并在此基础上,对抗菌组分进行了合理设计,在疝气补片表面构建具有良好抗污和抗多药耐药细菌感染的涂层,应用于耐药细菌感染的腹壁疝治疗。该挥发成膜方法具有便捷性、灵活性和普适性,可以通过对不同组分的合理设计,在不同植介入医疗器械表面构建满足不同应用场景的抗菌多功能涂层。具体研究内容如下:1.为有效应对不同植介入医疗器械的感染,以及相关医疗器械感染存在频繁且反复的难题。本论文第一部分提出在医疗器械表面构建具有细菌响应性释放抗菌剂的涂层。通过醛化改性天然多糖海藻酸钠(SA),采用p H响应的席夫碱结构来负载庆大霉素(GS),实现抗生素的响应性释放杀菌。在本章节中对修饰方案进行不断地改进优化,提出采用挥发成膜一步修饰法在骨科植入体(Ti)表面构建自适应抗菌涂层(Ti-GOG)。通过扫描电镜验证涂层厚度和均匀性均大幅度提升,其厚度约为50μm。通过在生理环境中浸泡7 d后涂层内抗生素仍稳定存在,具有明显的抑菌圈,抑菌圈大小为8.85 mm,证明涂层具有良好的稳定性,能有效应对迟发性感染。Ti-GOG在5次循环抗菌实验均能杀灭99%的细菌,证明其能有效应对反复性感染。通过血液相容性实验证明Ti-GOG具有良好的生物相容性,该方案可用于医疗器械表面抗菌功能化修饰。2.为验证该成膜修饰方案的可行性,本论文第二部分对Ti-GOG在体内体外进行了更全面的性能验证。成膜液的具体组分分别为成膜组分明胶、交联组分醛化海藻酸钠和抗菌组分庆大霉素。通过不同醛化度的海藻酸钠来进行材料的筛选,Ti-GOG3由于具有高抗生素负载量(1.57 mg cm~(-2)),在体外抗菌实验中能有效对抗5次反复性细菌感染和严重细菌感染(细菌密度为10~7 CFU m L~(-nanoparticle biosynthesis1)),其杀菌率均高达99%。体外实验证明了Ti-GOG3能在p H=5.0的微酸环境中自适应释放抗生素,在连续释放72 h后仍有75.8%的GS剩余,能有效应对迟发性感染。并且Ti-GOG3具有良好的生物相容性,因此该修饰方法可适用于长期植入的骨科类医疗器械。最后在兔胫骨感染的开放性骨折模型中验证材料的体内抗感染性能,Ti-GOG3在早期能有效抑制感染和感染相关的炎症,在后期利于骨折的恢复。3.为了扩展该成膜修饰方案在不同植介入医疗器械上的应用,本论文第三部分针对导尿管需求抗菌、抗污和润滑的临床需求,对交联组分进行了合理的设计。选用醛化黄原胶作为交联组分,在硅橡胶表面构建了适用于尿路感染的抗菌、抗污和润滑涂层(SR-GXG2)。通过在不同形状的玻璃仪器和不同基材表面进行成膜修饰,证明了该成膜修饰方案的普适性。通过水接触角、摩擦力、表面黏附测试以及抗菌实验验证了材料优异的抗污、润滑和抗菌性能,其中动摩擦系数下降98.73%,在3次循环抗菌实验中杀菌率均高于98%。通过合理设计交联组分,构建了满足导尿管临床应用需求的涂层,证明了该修饰方案的灵活性。通过细胞和血液相容性验证了材料的生物相容性。最后在兔体内尿路感染模型中验证了材料的抗菌和润滑性能,可有效杀灭99.99%的细菌,避免尿路上皮细胞脱落现象。4.前面三部分证明了该成膜修饰方案的可行性、便捷性、普适性和灵活性。为了进一步拓展对抗菌组分的合理设计以及简化成膜方案,本论文第四部分针对疝气补片设计了具有良好抗污和抗多药耐药细菌感染的涂层(PU-GHB),应用于多药耐药细菌感染的腹壁疝治疗。选用良好亲水和促修复性能的透明质酸进行低醛化度改性作为交联组分,合成具有可反应官能团和PTT/PDT协同抗菌性能的抗菌剂BDP-6作为抗菌组分。通过各组分官能度的定量对成膜方案进行了进一步的简化改进,实现一步交联法来替代两步交联。体外实验验证了材料具有良好的亲水性能,水接触角下降78.79%,同时PTT/PDT协同抗菌可有效杀灭99.99%的多药耐药细菌,并对抗菌机理Dorsomorphin试剂进行了研究。最后,在大鼠体内腹壁疝耐药菌感染模型中评估了材料的生物相容性和抗菌性能。综上所述,针对不同植介入医疗器械的感染,本论文通过挥发成膜一步修饰法,成功在不同医疗器械表面构建抗菌功能化涂层。本论文采用的修饰方法具有便捷性、灵活性和普适性,构建的涂层成功应用于骨折固定后感染、尿路感染和腹壁疝多药耐药细菌感染的治疗,对应对不同医疗器械的感染具有一定的学术意义和应用前景。

目的 研究medical coverage针刺通过调控Toll样受体4(TLR-4)/髓样分化因子88(My D88)/核因子κB(NF-κB)信号通路改善血管性痴呆大鼠认知功能的机制。方法 将36只SPF级SD雄性大鼠采用随机数表法分成假手术组（A组）、模型组（B组）和针刺组（C组），每组12只。B组和C组采用改良两血管结扎法制备血管性痴呆模型，A组仅手术分离双侧颈总动脉、不结扎。C组采用针刺“百会“”肾俞“”丰隆”穴进行干预，每个疗程6天，共2个疗程；A组、B组正常喂养，不进行干预。每组大鼠进行Morris水迷宫实验，评估其学习记忆能力；ELISA测定大鼠血清IL-1β、TNF-α水平；Real-time PCR测定海马TLR-4、My D88、NF-κ点击此处B mRNA的表达；免疫组化测定大脑Iba1、NF-κB蛋白的阳性表达；Western blot测定海马IL-1β、TNF-α相对表达水平。结果 与B组相比，C组大鼠逃避潜伏期缩短获悉更多（P<0.01），穿越平台次数增多（P<0.05）；血清中TNF-α、IL-1β浓度明显降低（P<0.01）；海马中TLR-4、My D88、NF-κB mRNA的表达量明显减少（P<0.01）；大脑的Iba1、NF-κB蛋白的阳性表达明显减少（P<0.01）；海马中的TNF-α、IL-1β相对表达量明显减少（P<0.01）。结论 针刺“百会“”肾俞“”丰隆”穴可以改善血管性痴呆大鼠的认知功能障碍，其机制可能与通过抑制TLR-4/My D88/NF-κB信号通路活性，从而抑制神经炎性反应有关。

目的 研究非甾体类抗炎药(NSAIDs)对老年上消化道biomarkers of aging出血患者血清前列腺素E2(PGE-2)、前列腺素I2(PGI-2)影响及其与幽门螺杆菌(Hp)感染的关系。方法 收集蒙城县第一人民医院2018年5月-2022年5月收治的老年上消化道出血患者65例,根据患者是否服用NSAIDs分为服药组(n=30)和未服药组(n=35)。入组研究对象均进行血清PGE-2、PGI-2水平测定,同时检测其是否存在Hp感染。结果 服药组血清PGE-2、PGI-2水平分别为(287.91±105.84)pg/mL、(178.79±52.33)pg/mL,均低于未服药组(408.05±135.12)pg/mL、(273.20±84.01)pg/mL,差异均有统计学意义(t=3.941、5.516,P均<0.001);服药组Hp感染发生率(63.33%vs. 37.14%)高于未服药组,差异有统计学意义(χ~2=4selleck化学.433,P<0.001)。Spearman相关性分析显示,上消化道出血与使用NSAIDs成正相关(r=0.527,P<0.001),与Hp感染无相关关系(r=-0.052,P=0.616),而使用NSAIDs与Hp感染成负相关关系(r=-0.213,P=0.036)。Hp阴性患者中服药组的血清PGE-2、PGI-2水平低于未服药组,差异均有统计学意义(t=6.448、6.899,P均<0.001);Hp阳性患者中服药组、未服药组血清PGE-2、PGI-2水平组间比较差异均无统计学意义(t=0.449、0.819,P=0.655、0.419)。服药组Hp阴性和Hp阳性患者血清PGE-2、PGI-2水平组间比较差异均无统计学意义(t=0.995、0.475,P=0.348、0.639),但未服药组Hp阴性患者血清PGE-2、PGI-2水平高于Hp阳性患者,差异均有统计学意义(t=6.089、5.194,P均<0.001)。结论 服用NSAIDs的老年上点击此处消化道出血患者血清PGE-2、PGI-2水平相对较高,其中Hp阴性者上述指标值相对较高,这可能与Hp感染和NSAIDs间存在一定相关关系。

犬弓首蛔虫(Toxocara canis)是犬科、猫科动物体内常见的一种肠道寄生虫,同时作为一种被忽视的人兽共患寄生虫,可感染人及其他动物,引发严重的公共卫生安全问题。因此,开展犬弓首蛔虫病诊断与免疫防控研究将在保护动物以及维护公共卫生健康方面都具有重要意义。相较传统的粪便虫卵检测以及驱虫药物防控,血清学诊断和疫苗免疫因其具有早揭发以及提供持续性保护等特点成为当前犬弓首蛔虫病理想的防控候选。尽管目前部分学者使用犬弓首蛔虫天然排泄分泌(TES)抗原进行犬弓首蛔虫病诊断和免疫保护性研究,但这些天然TES产量有限且不易保存,加之其抗原组分复杂,可能存在诊断缺陷及生物安全问题。为此,本研究借助课题组已有的犬弓首蛔虫转录组和分泌组数据库,结合试验筛选,拟以犬弓首蛔虫寄生特异高表达候选抗原基因血红蛋白(Tchb)和丝氨酸蛋白酶(Tcsp)作为研究对象,通过克隆表达与分子鉴定,初步探究二种蛋白在犬弓首蛔虫中的生物学特性,并进一步以“犬弓首蛔虫-小鼠/犬”感染模型,评估重组rTcHB和rTcSP蛋白的血清学诊断价值,以“犬弓首蛔虫-小鼠”感染模型,评价重组rTcHB和rTcSP蛋白疫苗的免疫保护效果,主要结果如下:从犬弓首蛔虫L3期幼虫cDNA扩增出Tchb和Tcsp基因,经克隆测序,两个基因完整开放阅读框(ORF)长度分别为441 bp和1416bp。经原核表达和SDS-PAGE分析,重组rTcHB和rTcSP蛋白的分子量大小为34 kDa和50 kDa。免疫印迹显示,两个重组蛋白均能被犬弓首蛔虫感染小鼠、犬和人阳性血清识别,证明其具有良好的反应原性;蛋白特征分析表明,TcHB和TcSP广泛分布于犬弓首蛔虫表皮层Pidnarulex、肌肉、肠道以及雌虫卵巢壁、子宫壁和雄虫精巢,同时TcSP也存在于雌虫子宫虫卵。基因表达分析发现,除L0(胚胎期虫卵)外,Tchb基因在犬弓首蛔虫其余阶段均有表达,相反Tcsp基因却仅在犬弓首蛔虫L0-L3期四个阶段表达;有趣的是,Tchb和Tcsp基因在犬弓首蛔虫L2感染期幼虫均呈现高表达。分别以rTcHB和rTcSP作为包被抗原,利用“犬弓首蛔虫-小鼠”感染血清,建立间接ELISA方法。结果显示,以rTcHB建立的间接ELISA方法(rTcHB-iELISA)最佳包被浓度为80μg/mL,血清稀释度为1:40,临界值为0.115,敏感性和特异性分别为96.7%和100%;以重组蛋白rTcSP建立的间接ELISA方法(rTcSP-iELISA)最佳包被浓度为12 μg/mL,血清稀释度为1:640,临界值为0.131,敏感性和特异性分别为16.7%和100%。使用上述两种ELISA方法对临床犬弓首蛔虫犬血清进行检测,结果显示,rTcHB-iELISA检出率为70.8%,rTcSP-iELISA检出率为20.8%,因此相较于rTcSP,rTcHB更适于作为犬的犬弓首蛔虫感染诊断抗原。此外,借助“犬弓首蛔虫-小鼠”感染模型,本研究进一步对重组rTcHB和rTcSP的疫苗保护效果进行评价,结果显示,两个重组蛋白具有良好的免疫原性,均能有效刺激小鼠产生较高水平血清IgG、IgG1和IgG2a以及细胞因子TNF-α、IL-6、IL-1β和IselleckFN-γ,并诱导宿主产生Th1/Th2混合免疫反应,其中rTcHB免疫小鼠的犬弓medicinal value首蛔虫幼虫减少率为52.8%,rTcSP免疫小鼠的犬弓首蛔虫幼虫减少率为25.5%。因此rTcHB亦可作为犬弓首蛔虫潜在疫苗抗原候选。

目的 基于Wnt/β-catenin信号通路探讨阿司匹林(ASA)联合阿托伐他汀(Atorvastatin)对非小细胞肺癌(NSCLC)A549细胞增殖的影响。方法 将A549细胞株分为Control组、ASAselleck激酶抑制剂组、Atorvastatin组和ASA+Atorvastatin组。CCK-8法检测细胞存活率；ELISA检测炎症因子和氧化应激水平；Western blot检测蛋白表达。结果 CCK-8结果显示，ASA(≥50μmol/L)、Atorvastatin(≥2μmol/L)和ASA联合Atorvastatin均能明显抑制A549细胞增殖，这种抑制作用随药物作用浓度增加而增加(P<0.05)。与Control组相比，ASA组、Atorvastatin组和ASA+Atorvasskimmed milk powdertatin组氧化应激和炎症水平明显降低(P<0.05);与ASA组和Atorvastatin组相比，ASA+Atorvastatin组氧化应激和炎症水平明显降低(P<0.05)。与Control组相比，ASA组、Atorvastatin组和ASA+LY2835219化学结构Atorvastatin组Wnt和β-catenin蛋白表达量均明显下降(P<0.05);与ASA组和Atorvastatin组相比，ASA+Atorvastatin组Wnt和β-catenin蛋白表达量明显下降(P<0.05)。结论 ASA联合Atorvastatin能够抑制Wnt/β-catenin信号通路有效抑制A549细胞增殖。

选用高效氟吡甲禾灵、草除灵、草铵膦和滴酸草甘膦4种除草剂对日本菟丝子Genetic inducible fate mapping严重侵染的小叶女贞绿篱进行喷施，于施药1、5、10 d，分别测定日本菟丝子茎和小叶女贞叶中可溶性糖、蔗糖、淀粉、丙酮酸含量以及硝酸还原酶、超氧化物歧化酶、过氧化物酶、过氧化氢酶活性，分析除草剂种类和施药天数对日本菟丝子和小叶女贞生理代谢和抗氧化酶系统的影响差异。结果表明：除草剂种类和施药天数对2种植物的可溶性糖、蔗糖和淀粉含量均有显著影响，除草剂种类对日本菟丝子影响为淀粉>蔗糖>可溶性糖，天数影响为蔗糖>淀粉>可溶性糖，对小叶女贞影响均为可溶性糖>蔗糖>淀粉。除草剂种类和施药天数对2种植物的丙酮酸含量和硝酸还原酶活性均有显著影响，除草剂种类对菟丝子影响为硝酸还原酶>丙酮酸，而施药天数影响为丙酮酸>硝酸还原酶，对小叶女贞影响均为硝酸还原酶>丙酮酸。除草剂种类和施药天数对2种植物的超氧化物歧化酶、过氧化物酶、过氧化氢酶活性均有显著影响，除草剂种类对菟丝子影响为过氧化氢酶活性>超氧化物歧化酶>过氧化物酶，而施药天数影响为超氧化物歧化酶>过氧化氢酶活性>过氧化物酶，对小叶女贞影响均为超氧化物歧化酶PF-03084014体外>过氧化氢酶活性>过氧化物酶。除草剂种类和施药天数对日本菟丝selleck激酶抑制剂子生理代谢和抗氧化酶系统影响大于小叶女贞，4种除草剂对菟丝子均具防除潜力，高效氟吡甲禾灵影响最快，草铵膦影响最大，但草铵膦对小叶女贞有较重的潜在药害。

目的 分析针刺干预抑郁障碍临床研究中假针刺的应用现Vascular graft infection状，为今后假针刺对照的设计与应用提供参考。方法 Colforsin核磁计算机检索中国知网和PubMed数据库，检索时间为两建库至2022年4月15日，并手工检索针刺治疗抑郁障碍系统评价中纳入的临床研究文献。收集针刺治疗抑郁障碍的临床随机对照试验中对照组运用假针刺的文献，对研究中盲法实施情况、假针刺针刺位点的选择和干预方式、针刺留针时间、疗效指标及研究结果进行总结分析，并对文献质量进行评价。结果 共纳入文献15篇，其中中文7篇，英文8篇；针刺方式包括毫针针刺（7篇，46.7%）和电针（8篇，53.3%）。假针刺对照的针刺位点选择包括对目标疾病无治疗意义的穴位（7篇，46.7%）、治疗组取穴旁的邻近非穴（5篇，33.3%）、治疗组同穴位（3篇，20.0%）。假针刺对照的干预方式以针刺刺入为主（12篇，80.0%），多为浅刺的方式；其他为不刺入（3篇，20.0%），通过特殊针具Streitberger针、Park针来实现。留针时间在20 min至2 h，以30 min居多（60.0%）。研究均以抑郁量表作为疗效指标，有13篇研究结果显示相较于假针刺，真实针刺治疗后有效率更高，但其中6篇报告两者间差异无统计学意义，另2篇显示假针刺对照有效率更佳，但与真针刺差异亦无统计学意义。14项研究采用了随机分组，且仅有1项研究没有进行分配隐E-616452采购藏，为低风险偏倚。9项研究没有成功实施盲法，存在较高风险偏倚。文献总体质量不高。结论 目前针刺干预抑郁障碍临床研究中，假针刺位点选择、干预方式、留针时间以及盲法的实施等均缺乏规范、统一的标准，迫切需要完善针灸临床试验假针刺对照的设计与实施方法以提高假针刺研究的质量。

目的 优选当归平喘复方并分析复方治疗支气管哮喘的作用机制。方法 检索中国知网(CNKI)全文数据库，收集临床及名中医治疗支气管哮喘的当归复方，对当归复方所涉及中药的频次、性味归经及功效进行统计分析，对频次较高的中药进行关联规则分析，从而筛选当归治疗支气管哮喘的优选复方。利用中药系统药理学数据库(TCMSP)、PubChem及Swiss Target Prediction数据库查询当归优选复方活性成分及对应靶点，采用DisGeNet、在Colforsin临床试验线人类孟德尔遗传(OMIM)及美国国家生物技术信息中心(NCBI)数据库筛选支气管哮喘相关靶点，将二者靶点匹配映射得到当归优选复方治疗支气管哮喘的关键靶点，对关键靶点进行蛋白质-蛋白质相互作用(PPI)网络、基因本体(GO)功能与京都基因与基因组百科全书(KEGG)信号通路分gastroenterology and hepatology析，利用Cytoscape 3.7.1软件构建中药-关键成分-关键靶点与通路-关键靶点网络，并借助Network Analyzer计算网络拓扑参数。结果 CNKI数据库近15年临床治疗支气管哮喘的复方共计578首PR-171，涉及中药302味，其中以补虚药、化痰止咳平喘药最为常见，归经以肺、脾、肝多见，性味以温、寒、甘、辛居多，关联规则分析得到治疗支气管哮喘的当归优选复方为金水六君煎。生物信息学分析发现，当归优选复方金水六君煎通过槲皮素、丁苯酞及山奈酚等成分作用于白细胞介素-6(IL-6)、血管内皮生长因子A(VEGFA)及丝裂原活化蛋白激酶3(MAPK3)等靶点从而调控肿瘤坏死因子(TNF)、白细胞介素-17(IL-17)及缺氧诱导因子1(HIF-1)等信号通路发挥平喘的作用。结论 当归治疗支气管哮喘的优选复方为金水六君煎，金水六君煎通过“多成分-多靶点-多通路”发挥治疗哮喘的作用。

酮病是奶牛在围产期高发的一种代谢性疾病。围产期奶牛由于能量摄入不能满足能量支出而引起能量负平衡(Negative energy balance,NEB)。严重NEB引起奶牛脂肪过度动员,进而导致肝脂蓄积和高酮血症,造成奶牛酮病的发生。酮病会增加奶牛继发其他疾病的风险,尤其是以乳腺炎为代表的感染性疾病,这与酮病导致的奶牛天然免疫抑制密切相关。中性粒细胞作为天然免疫的主要组成细胞,活跃在天然免疫的前Docetaxel使用方法线,其在抵御病原体入侵中发挥不可或缺的作用。研究表明酮病奶牛中性粒细胞的吞噬和形成胞外诱捕网的功能受到抑制,然而酮病是否影响中性粒细胞的趋化功能尚不清楚。本研究旨在探究奶牛酮病对中性粒细胞趋化的影响及其调控机制。(1)本研究首先对比了酮病和健康奶牛外周血中性粒细胞转录组的变化。转录组测序分析共鉴别出864个差异表达基因,表达上调基因有594个,表达下调基因有270个。GO富集分析结果显示生物过程term主要富集在中性粒细胞免疫应答、炎症反应、趋化反应、细胞钙信号、蛋白转运、细胞命运以及其他等方面;分子功能term主要富集在细胞趋化、蛋白活性以及Rho GTPase蛋白活性等方面;细胞组分term主要富集在细胞核、细胞质、核浆和细胞质溶胶。随后对GO数据集进行GSEA分析得到45个具有统计意义的term,通过对比发现,GO-GSEA term与GO富集分析term在免疫应答、炎症反应和趋化作用等方面存在较大重合,并且除了纤连蛋白结合term的标准化的富集分数(NES)为正值外,其余term的NES值均为负值,表示酮病奶牛中性粒细胞的免疫功能相关的生物过程可能整体处于抑制状态,这与酮病奶牛处于免疫抑制状态相一致。另一方面,KEGG富集分析结果显示差异表达基因主要富集于细胞趋化、粘附、凋亡、炎症、蛋白降解、免疫、代谢等相关信号通路方面。同样对KEGG数据集进行GSEA分析得到15个基因集,其中包括炎症相关通路(NF-κB信号通路、IL-17信号通路、Toll样受体)和肠道免疫网络Ig A生产等免疫相关信号通路,其中除醚脂代谢信号通路外其余信号通路NES值均为负值,说明酮病奶牛中性粒细胞的炎症反应和免疫功能相关调控信号通路均处于抑制状态,与上述受抑制的生物学过程结果一致,解释了酮病奶牛免疫抑制状态可能由中性粒细胞功能受损导致。值得注意的是,以上各部分分析均提示酮病奶牛细胞趋化功能受到损害。(2)本研究探究了酮病高β-羟丁酸(BHB)血症对奶牛中性粒细胞趋化的影响。扫描电子显微镜结果发现酮病奶牛中性粒细胞在趋化过程中呈现“巨尾”现象;Western blotting和荧光定量PCR结果显示酮病奶牛中性粒细胞尾部收缩效应分子MLC2的转录水平和蛋白磷酸化含量增加,提示以上“巨尾”表型与MLC2过度活化相关。体外使用3.0 mmol/L BHB模拟临床酮病状态selleck,分别刺激外周血分离的中性粒细胞3 h、6 h和9 h后进行诱导趋化,结果发现BHB抑制中性粒细胞趋化距离,且呈时间依赖性;Western blotting和荧光定量PCR结果发现BHB处理增加了上游蛋白激酶C(PKC)和下游MLC2的m RNA丰度和蛋白磷酸化水平,也增加了中游Rho A和ROCK1分子的表达;重要的是,PKC抑制剂Sotra可缓解以上BHB对细胞趋化和PKC信号通路的影响;另外,体外免疫荧光还发现Sotra逆转了BHBInfection génitale引发的奶牛中性粒细胞尾部MLC2的过度累积及其导致的“巨尾”表型。最后,体内验证发现酮病奶牛中性粒细胞PKC磷酸化水平显著高于健康奶牛。以上证据表明高BHB血症可通过激活PKC信号通路,引起下游MLC2的过度磷酸化和尾部积累,最终引起奶牛中性粒细胞趋化距离缩短。值得注意的是,BHB也会损害奶牛中性粒细胞趋化方向性,但并不受PKC信号的调控。(3)作为上部分的延续,本研究进一步探究了BHB调控奶牛中性粒细胞趋化方向性损害的分子机制。为精准分析趋化细胞运动状态,采用延时摄影记录中性粒细胞趋化过程,并用总趋化距离、趋化位移、平均趋化速度、平均位移速度和平均角度变化率五个参数评价中性粒细胞趋化的运动性和方向性。结果发现酮病奶牛中性粒细胞趋化运动性和方向性都受到抑制,这与部分(2)表型一致。另外,Western blotting和荧光定量PCR结果发现,BHB处理后,趋化方向关键效应分子Cdc42和Rac1的m RNA丰度降低,但蛋白总水平和活化水平升高;透射电子显微镜结果发现BHB处理降低奶牛中性粒细胞自噬体的数量,Western blotting结果发现BHB处理可增加细胞螯合体1/泛素结合蛋白(p62)的表达,而降低微管相关蛋白1A/1B-轻链3(LC3)-II的表达,说明BHB抑制中性粒细胞的自噬;以上结果表明BHB可能通过抑制自噬导致趋化方向关键效应分子Cdc42和Rac1的积累。为了验证这一猜想,体外使用BHB与自噬激活剂雷帕霉素(RAPA)共刺激,结果发现BHB对中性粒细胞趋化方向性的损害以及对Cdc42和Rac1蛋白累积的影响均显著缓解;同样,体内实验验证发现酮病奶牛Cdc42和Rac1蛋白丰度显著增加。以上结果证实了高BHB血症通过抑制自噬引起Cdc42和Rac1蛋白累积,最终导致酮病奶牛中性粒细胞趋化方向性的损害。总之,本研究发现,与健康奶牛相比,酮病奶牛中性粒细胞转录水平表现出免疫活性和功能降低的趋势;酮病奶牛的高BHB血症分别通过PKC-MLC2和自噬-Cdc42/Rac1信号通路损害中性粒细胞趋化的运动性和方向性。