目的：Y-27632探讨岭南背针对肾阳亏虚型良性前列腺增生症(BPH)的疗效。方法：选取广东省第二中医院收治的84名良性前列腺增生患者，随机分为观察组和对照组，每组42例。对照组采用常规针灸治疗，观察组采用岭南背针治疗，对治疗前后患者国际前列腺SPR immunosensor症状(IPSS)评分、生活质量(QoL)评分、最大尿流率(Qmax)、残余尿量(RU)和临床疗效进行观察。结果：经过4个疗程治疗后，两组患者的IPSS评分、QoL评分和RU均低于治疗前(P<0.05),Qmax高于治疗前(P<0.05);观察组IPSS评分、QoL评分和RU显著低于对照组(P<0.05或P<0.01),Qmax显著高于对照组(P<0.05)。观察组总有效率为75.00%(30/40),高于对照组56.41%(22/39),差异有统计学意义(P<0.05);两组均无严重不良反应。结论：肾阳亏虚型良性前列腺增生症运用岭南背针治疗，优于常规针刺，疗效显OXPHOS抑制剂著，可改善患者尿道梗阻症状，减少排尿次数，促进排尿功能恢复，改善性功能和生活质量，具有高安全性和临床推广意义。
温肾益气、缩尿止遗法在前列腺增生术后改善尿控中的效果
目的 研究温肾益气、缩尿止遗法在前列腺增生术后改善尿控的临床疗效。方法 选取2018年3月-2022年12月在我院行手术治疗的84例前列腺增生患IACS-010759作用者为研究对象，采用随机数字表法分为对照组（41例）和观察组（43例）。对照组采用温肾益气法治疗，观察组采用温肾益气、缩尿止遗法治疗，比较两组尿控恢复率、尿控恢复时间、尿控恢复指标（膀胱残余尿量、漏尿次数、漏尿量）、尿失禁发生情况、尿piezoelectric biomaterials动力学指标及生活质量。结果 观察组尿控恢复率高于对照组，尿控恢复时间短于对照组（P<0.05）；观察组膀胱残RAD001核磁余尿量、漏尿次数、漏尿量均小于对照组（P<0.05）；观察组尿失禁（Ⅰ级、Ⅱ级）发生率低于对照组（P<0.05）；治疗后观察组最大尿流率（Q_(max)）、最大尿道闭合压（MUCP）均大于对照组（P<0.05）；两组治疗后生活质量水平均高于治疗前，且观察组高于对照组（P<0.05）。结论 温肾益气、缩尿止遗法在前列腺增生术后改善尿控中具有良好的疗效，可提高尿控恢复率，缩短尿控恢复时间，减少膀胱残余尿量、漏尿次数和漏尿量，降低尿失禁发生率，改善尿动力学指标，提高患者术后生活质量。
77例肺炎克雷伯菌致血流感染的患者临床特征和预后分析
目的 分析肺炎克雷伯菌导致血流感染患者的临床特征与感染菌株的药敏情况，探究容易感染仅对氨苄西林耐药菌株患者的临床特征，寻找影响预后的可能因素。方法回顾性分析2019年1月1日至2021年12月31日福州市第二医院收治的77例肺炎克雷伯菌导致血流感染患者的临床资料。进行血液细菌培养，阳性标本行菌株鉴定及药敏分析。根据肺炎克雷伯selleckchem BMS-354825菌药敏试验结果，将患者分为仅对氨苄西林耐药菌株组（51例）和非仅对氨苄西林耐药菌株组（26例）。根据临床转归，将患者分为预后良好组（55例）与预后不良组（22例）。对不同组间患者的临床资料、实验室指标、药敏试验结果与临床干预措施进行单因素分析与二元多因素Logistic分析。结果 共检出77株肺炎克雷伯菌，其中碳青霉烯类敏感肺炎克雷伯菌70株（90.9%），碳青霉烯类耐药肺炎克雷伯菌7株（9.1%）。在仅对氨苄西林耐药菌株组与非仅对氨苄西林耐药菌株组间，患者是否入住ICU、年龄、合并糖尿病以及肝Urban airborne biodiversity脓肿的各项影响因素的差异均具有统计学意义（P <0.05）。在预后良好组与预后不良组间，包括最低白蛋白水平、最低血色素水平、最低血小板计数水平、患者是否入住ICU、感染碳青霉烯类耐药菌株以及合并脓毒症的各项指标，差异具有统计学意义（P<0.05）。合并脓毒症（OR=4.939,95%CI:1.208～20.201,P=0.026）是预后不良的独立危险因素。结论 合并糖尿病的肝脓肿患者更易出现肺炎克雷伯菌导致的血流感染。患者感染碳青霉烯耐药的肺炎Bemcentinib克雷伯菌、实验室检查结果提示血白蛋白水平、血色素水平与血小板水平严重降低可能与不良预后相关。肺炎克雷伯菌导致血流感染的患者合并脓毒症是预后不良的独立危险因素。
中文版FACT-Leu量表在成人恶性血液疾病患者中的信效度检验
目的 评价中文版白血病生活质量评估量表(Functional Assessment of Cancer Therapy-Leukemia, FACT-Leu)在成人恶性血液病患者中的信度和效度。方法 分别通过便利抽样选取2022年4月—2022年7月的244例恶性血液病患者进行问卷调查和对10名血液病相关护理专家进行2轮问卷函询，探索量表的信效度。结果 信度分析显示：除条目14与量表得分间r=0.009(P>0.05),其余各条目与总量表之间的r值为0.331～0.826(均P<0.01);各条目高分组(总分排序前27%)与低分组(总分排序后27%)CR值在11.221～31.250(P<0.05);内部一致性信度(Cronbach′s α系数)、折半信度(Spearman-Brown系数)和重测信度分别为0.915、0.784和0.807。效度分析3-MA显示：2轮专家函询S-CVI分别为0.856、0.884;I-CVI分别为0.912、0.897;采用主成分分析，提取出5个公因子，累此网站计方差贡献率为76.826%;是否对性生活满意条目不属于任何维度，原本属于功能状况维度的7个条目出现了交叉载荷现象；量表总分及各维度得分与QLQ-C30量表总分间均呈正相关，量表总分间的Pearson相关系数为0.646(P<0.05);对比不同特征患者的得分情况，结果显示不同年龄、工作状态、婚姻状态、有无补救助、自理能力、不同诊断、近1周有无感染和出血等分组consolidated bioprocessing患者得分间差异有统计学意义(P<0.05)。结论 中文版FACT-Leu量表在恶性血液病群体中使用信度较好，在效度检验中发现，功能状况维度与白血病特异性维度部分内容存在双载荷现象，可以考虑是否有必要将白血病特异性条目与其他条目融合，开发出针对血液病患者的条目凝练、简化版本的问卷，有待深层次的研究探索。
VCAM-1在软骨修复中对人骨髓间充质干细胞的作用研究
目的:骨髓间充质干细胞的迁移归巢及成骨、成软骨分化在骨与软骨损伤修复中扮演关键角色,VCAM-1(血管内皮粘附分子-1)蛋白通过细胞粘附促进白细胞迁移并介导炎症,而损伤、炎症、退行性疾病与铁死亡发生密切相关,目前对VCAM-1蛋白在人骨髓间充质干细胞(HBMSCs)的相关研究较少。本研究主要通过体外实验初步探讨VCAM-1蛋白对HBMSCs的迁移以及铁死亡方面的作用。方法:首先提取人骨髓来源的骨髓间充质干细胞,通过分离、培养并鉴定其人骨髓间充质干细胞(HBMSCs)表型。通过Transwell迁移实验检测不同浓度VCAPexidartinib核磁M-1对HBMSCs的迁移作用。使用重组VCAM-1蛋白、铁死亡诱导剂(RSL-3)、铁死亡抑制剂(Fer-1)处理HBMSCs,后续实验分组为Control组、VCAM-1组、RSL-3组、VCAM-1+RSL-3组、VCAM-1+RSL-3+Fer-1组,利用CCK8检测RSL-3诱导HBMSCs铁死亡的最佳造模浓度,同时检测不同浓度VCAM-1联合RSL-3对HBMSCs的活性影响。通过荧光探针检测VCAM-1蛋白处理后的HBMSCs的活性氧(ROS)表达变化,同时检测各组脂质过氧化物(LPO)的含量变Anti-retroviral medication化,再通过JC-1荧光探针检测细胞线粒体膜电位的变化。最后通过RT-q PCR检测铁死亡相关基因(GPX4、SLC7A11、ACSL4)的表达,细胞免疫荧光检测GPX4蛋白表达情况。结果:通过提取、培养的HBMSCMK-2206化学结构s经流式细胞术结果显示表面分子CD73、CD90分别表达96.42%、95.25%;CD34、HLA-DR分别表达0.07%、0.14%,符合HBMSCs的表面标记物鉴定标准。Transwell迁移实验显示,VCAM-1可促进HBMSCs迁移,在浓度为200ng/ml时,促进细胞迁移能力最强,差异有统计学意义(P<0.01)。RSL-3可以诱导HBMSCs铁死亡,降低细胞活力(P<0.01),处理4小时的半抑制浓度(IC50)为0.308 u M,同时VCAM-1浓度在200ng/ml-800ng/ml时可增加RSL-3对HBMSCs的细胞毒性作用(P<0.01);VCAM-1可以增加HBMSCs的ROS及LPO表达(P<0.01),并促进RSL-3诱导的LPO累积和线粒体膜电位降低(P<0.05,(RSL-3)组VS(VCAM-1+RSL-3)组),同时Fer-1可以恢复LPO表达及线粒体膜电位至正常水平(P>0.05,(VCAM-1+RSL-3+Fer-1)组VS Control组);VCAM-1能抑制GPX4的m RNA表达水平,同时促进ACSL4的m RNA表达水平且均能被Fer-1逆转(P<0.05),但并未抑制SLC7A11的m RNA表达水平(P>0.05);虽然VCAM-1在蛋白水平未能明显抑制GPX4表达(P>0.05),但促进了RSL-3诱导的GPX4表达抑制(P<0.05,(RSL-3)组VS(VCAM-1+RSL-3)组),同时Fer-1在一定程度能保护GPX4蛋白的表达(P<0.01,(VCAM-1+RSL-3+Fer-1)组VS(VCAM-1+RSL-3)组)。结论:VCAM-1蛋白促进HBMSCs的迁移能力,但同时也可能通过增加ROS、LPO的累积及线粒体损伤来促进RSL-3诱导的铁死亡。
基于GRADE分级及Meta回归探究针药结合治疗过敏性鼻炎疗效的循证评价
目的:以针药结合治疗过敏性鼻炎(Allergic rhinitis,AR)随机对照试验为研究对象,采用循证医学的Cochrane方法学评价工具,评价纳入研究的质量。基于GRADE证据分级系统,划分主要结局指标的证据等级。同时,运用常规Meta分析,比较针灸+中药VS中药、针灸+中药VS针灸、针灸+西药VS西药和针灸+西药VS针灸四类干预模式的疗效差异。运用Meta回归及亚组分析,找出可能的异质性来源。本研究为今后针药结合治疗AR的临床决策提供了系统性证据。方法:1.文献检索:系统检索中国生物医学CBM(1979-2023)、中国知网CNKI(1979-2023)、万方Wan Fang(1998-2023)、重庆维普数据库VIP(1989-2023)、Pub Med数据库(1966-2023)、web of science数据库(1963-2023)和Cochrane Library数据库的随机对照临床试验。检索时间截止2023年2月10日。2.文献筛选与提取:初次筛选使用Note Express3.7.0软件,剔除重复的文献。再根据作者、题目等基本信息进行第二次人工查重。再次筛选:初步浏览标题和摘要,排除和本研究明显不相符合的文献。如:实验研究、个案报道等。最终筛选:对于无法确定是否纳入的研究,选择下载全文来决定是否排除。如:自身前后对照试验等。确定纳入研究:按照预先设定的纳排标准,确定纳入RCT的数量。选择WPS表格11.1.0软件进行文献资料的数据提取。3.文献计量学:选用Microsoft excele表格对纳入文献的腧穴、中药和方剂名称资料进行提取、整理与分析。4.质量评价:运用Cochrane偏倚风险评估工具评价RCT的方法学质量。5.证据质量分级:根据结局指标使用GRADE pro3.6软件对纳入的随机对照试验的证据质量进行评估,分为高、中、低和极低四级,严格评价证据等级。6.统计学分析6.1常规Meta分析选择Rev Man5.4.1软件用于数据资料的Meta分析。二分类数据资料选择相对危险度(RR)进行分析。连续型数据资料选择标准化均数差(SMD)进行分析,效应量的大小均用95%CI,P≤0.05是差异具有统计学意义的标准。同时制作森林图和漏斗图。分析判断纳入研究之间的异质性大小和来源。I2值和P值的大小代表异质性的程度。若P>0.1,I2≤50%,则认为研究间的异质性很小或无,选择固定效应模型进行统计分析;I2>50%,则采用随机效应模型。对于异质性较大的,主要从临床、方法学和统计学三方面来考虑可能的异质性来源。6.2 Meta回归选择Rev Man5.4.1、Stata12.0软件进行数据资料的亚组分析。二分类数据资料选择相对危险度(RR)进行分析。效应量的大小均用95%CI,P≤0.05是差异具有统计学意义的标准。分析判断纳入研究之间的异质性大小和来源。I2值和P值的大小代表异质性的程度。对于异质性较大的,将推断异质性来源。结果:1.文献分析:本研究总共纳入199篇针药结合治疗AR的RCT研究,通过对纳入的相关文献选穴规律情况进行分析,选用的穴位有72个,根据所用频次排序选取前10:肺俞(n=101)、迎香(n=93)、印堂(n=74)、大椎(n=74)、足三里(n=70)、合谷(n=60)、肾俞(n=此网站56)、脾俞(n=50)、风门(n=38)、风池(n=22);文献使用方剂情况进行分析,文献中所运用的方剂达33种,根据所用频次排序选取前3:玉屏风散(n=5)、摄涕止鼽汤(n=3)、益气温阳方(n=3);文献使用中药情况进行分析,文献中所运用的中药达101味,根据所用频次排序选取前10:细辛(n=80)、黄芪(n=75)、防风(n=66)、白术(n=63)、白芷(n=61)、辛夷(n=59)、苍耳子(n=59)、甘草(n=58)、白芥子(n=37)、五味子(n=34)。2.方法学质量评价:本研究总共纳入199篇RCT研究,有92篇RCT研究给出了详细的随机方法。21篇RCT研究报告了具体的分配隐藏方法。有3篇RCT研究给出了详细的对研究者和受试者施盲的介绍。有6篇RCT研究提及了对研究结局的评价实施盲法。182篇RCT研究的结果数据完整。2篇RCT研究存在选择性报告,其他风险偏倚描述尚不足。纳入研究的质量总体上偏低,高风险评价为主,可见纳入的RCT研究的方法学质量普遍堪忧。3.证据质量分级:(1)针灸+西药vs西药:结局指标的GRADE评级:总有效率为中级,RQLQ、TNSS、TNNSS、Ig E和EOS为“?○○○”极低级。6个结局指标均存在研究的局限性。(2)针灸+西药vs针灸:结局指标的GRADE评级:总有效率、TNSS、TNNSS为低级,RQLQ、Ig E和EOS为“?○○○”极低级。6个结局指标均存在研究的局限性。(3)针灸+中药vs中药:结局指标的GRADE评级:总有效率为“???○”中级,RQLQ和Ig E为低级,TNSS和EOS为“?○○○”极低级。5个结局指标均存在研究的局限性。(4)针灸+中药vs针灸:结局指标的GRADE评级:总有效率、RQLQ、TNSS和Ig E为“??○○”低级,EOS为“?○○○”极低级。5个结局指标均存在研究的局限性。4.常规Meta分析4.1针灸+西药vs西药疗效比较的Meta分析本组总有效率纳入49项研究,4999例。RQLQ纳入18项研究,1415例。TNSS纳入12项研究,1364例。TNNSS纳入9项研究,1136例。Ig E纳入11项研究,904例。EOS纳入2项研究,138例。分析总有效率、RQLQ、TNNS、TNNSS、Ig E和EOS 6个结局指标。总有效率meta分析结果显示,RR=1.21,95%CI[1.16,1.26],针灸+西药优于西药。RQLQ评分的meta分析结果显示,SMD=-1.60,95%CI[-2.17,-1.02],在RQLQ评分方面,针灸+西药比西药评分更低。TNSS评分的meta分析结果显示,SMD=-1.60,95%CI[-2.22,-0.97],在TNSS评分方面,针灸+西药比西药评分更低。TNNSS评分的meta分析结果显示,SMD=-0.70,95%CI[-0.97,-0.42],在TNNSS评分方面,针灸+西药比西药评分更低。Ig E评分的meta分析结果显示,SMD=-1.30,95%CI[-1.91,-0.68],在TNNSS评分方面,针灸+西药比西药评分更低。EOS的meta分析结果显示:SMD=-0.14,95%CI[-0.48,0.19],在EOS评分方面,针灸+西药比西药评分更低。4.2针灸+西药VS针灸疗效比较的Meta分析本组总有效率纳入9项研究,645例。RQLQ纳入4项研究,241例。TNSS纳入1项研究,60例。TNNSS纳入1项研究,74例。Ig E纳入2项研究,150例。EOS纳入1项研究,4例。分析总有效率、RQLQ、TNNS、TNNSS、Ig E和EOS 6个结局指标。总有效率的meta分析结果显示,RR=1.18,95%CI[1.04,1.33],针灸+西药疗法优此网站于针灸;RQLQ的meta分析结果显示,SMD=-0.50,95%CI[-1.06,0.05],在RQLQ评分方面,针灸+西药比针灸评分更低;TNNS的meta分析结果显示,SMD=-0.80,95%CI[-1.33,-0.27],在TNSS评分方面,针灸+西药比针灸评分更低。TNNSS的meta分析结果显示,SMD=-0.63,95%CI[-1.10,-0.17],在TNNSS评分方面,针灸+西药比针灸评分更低。Ig E的meta分析结果显示,SMD=-0.98,95%CI[-2.27,0.31],在Ig E评分方面,针灸+西药比针灸评分更低。EOS的meta分析结果显示,SMD=0.35,95%CI[-0.29,0.99],在EOS评分方面,提示试验组与对照组在降低EOS水平方面均无明显差异。4.3针灸+中药VS中药疗效比较Meta分析本组总有效率纳入36项研究,3367例。RQLQ纳入8项研究,667例。TNSS纳入3项研究,216例。TNNSS纳入0项研究,0例。Ig E纳入7项研究,527例。EOS纳入1项研究,64例。分析总有效率、RQLQ、TNNS、Ig E和EOS 5个结局指标。总有效率的meta分析结果显示,RR=1.17,95%CI[1.13,1.21],针灸+中药优于中药。RQLQ的meta分析结果显示,SMD=-2.09,95%CI[-3.21,-0.98],在RQLQ评分方面,针灸+中药比中药评分更低。TNNS的meta分析结果显示,SMD=-0.96,95%CI[-1.63,-0.29],在TNSS评分方面,针灸+中药比中药评分更低。Ig E的meta分析结果显示,SMD=-1.14,95%CI[-2.06,-0.21],在Ig E评分方面,针灸+中药比中药评分更低。EOS的meta分析结果显示,SMD=-2.18,95%CI[-2.81,-1.56],在EOS评分方面,针灸+中药比中药评分更低。4.4针灸+中药VS针灸疗效比较的Meta分析本组总有效率纳入49项研究,4999例。RQLQ纳入18项研究,1415例。TNSS纳入12项研究,1364例。TNNSS纳入9项研究,1136例。Ig E纳入11项研究,904例。EOS纳入2项研究,138例。分析总有效率、RQLQ、TNNS、Ig E和EOS 5个结局指标。总有效率的meta分析结果显示,RR=1.27,95%CI[1.13,1.43],针灸+中药优于单纯针灸。RQLQ的meta分析结果显示,SMD=-2.0Febrile urinary tract infection3,95%CI[-2.97,-1.08],在RQLQ评分方面,针灸+中药比针灸评分更低。TNNS的meta分析结果显示,SMD=-1.27,95%CI[-2.78,0.24],在TNSS评分方面,针灸+中药比针灸评分更低。Ig E的meta分析结果显示,SMD=-0.02,95%CI[-0.23,0.20],在Ig E评分方面,针灸+中药比针灸评分更低。EOS的meta分析结果显示,SMD=-1.75,95%CI[-2.33,-1.16],在EOS评分方面,针灸+中药比针灸评分更低。5.Meta回归通过Meta回归发现,干预方式是有效率合并分析异质性的来源。针灸+西药vs西药的亚组分析显示:异质性检验结果为P=0.01,I2=76.7%,组间差异性较大,意味着干预方式的选择会影响Meta分析结果,合并所有结果,效应量为1.21,且有显著性(Z=10.55,P<0.0001),达到了大效应量,说明干预方式的改变是异质性的来源;针灸+中药vs中药的亚组分析异质性检验结果为P=0.34,I2=0%,组间未发现明显异质性。Meta分析结果,合并所有结果,效应量为1.27,且有显著性(p=0.006),达到了大效应量,说明干预方式的改变是异质性的来源。结论:1.通过文献计量学分析表明,总结了针灸治疗AR的腧穴主要以肺俞、迎香、印堂等补肺益气,祛风散寒通鼻窍的腧穴为主;所选的中药多为细辛、黄芪、防风、白术等解表散寒通窍、益气补肾的中药为主;所选的方剂多为玉屏风散、摄涕止鼽汤、益气温阳方等益气温阳、补肺益肾之功的方剂为主。2.目前国内外针药结合治疗AR的RCT研究的质量尚有待提高,各项结局指标的GRADE证据分级普遍偏低,建议今后进行的临床研究应严格按照Cochrane推荐的偏倚风险评估工具和Grade证据分级系统进行规范的报告。3.从Meta分析得出针灸+中药或针灸+西药的针药结合治疗AR在总有效率、RQLQ、TNSS、TNNSS、Ig E及EOS评分改善上均优于其他的单一治疗方式治疗。4.Meta回归分析得出研究的异质性来源基本证实。进一步的RCT基本很难改变结论。
乙醛脱氢酶2在主动脉瘤/夹层中的细胞特异性作用及其机制研究
研究背景主动脉瘤/夹层(Aortic aneurysm and dissection,AAD)是一类发病急、预后凶险和病死率高的疾病。主动脉瘤指主动脉呈不可逆性瘤样扩张(超过正常血管直径的50%)。主动脉夹层指主动脉腔内血液通过内膜破口渗入主动脉壁中层,使血管壁分为真假两腔。65岁以上的男性中,AAD的发病率高达9%。目前AAD主要通过手术干预,缺乏有效的药物治疗方案,因此急需寻找新的治疗靶点。既往研究发现,AAD的发病是多种内、外因素共同作用的结果,吸烟、高血压、动脉粥样硬化、糖尿病、高龄均是其危险因素,其机制涉及遗传、环境和生物学因素多个方面。目前主要认为AAD有以下病理特点:中膜血管平滑肌细胞的功能障碍、炎症细胞的浸润、细胞外基质的降解,其中血管平滑肌细胞的功能障碍已被证实在疾病发生发展过程中发挥了关键作用。收缩型血管平滑肌细胞可维持血管张力,维持血管健康状态。然而,在病理条件下,收缩型平滑肌细胞可以去分化为一种分泌表型,通过分泌胞外囊泡、增殖和迁移来修复损伤,这一过程称为表型转换,并且已被证实是AAD的关键起始步骤。AAD患者早期发病隐匿,常无明显症状,如果不及时进行手术干预,死亡率高达90%以上。AAD发病机制不明,目前尚无有效措施延缓其主动脉扩张过程。研究AAD发病机制,寻找早期治疗靶点,对于延缓AAD早期进展,防止其破裂和减少手术几率具有重要意义。最新研究表明,作为血管第一道防线的内皮细胞(Endothelial cells,ECs)在AAD发生发展中发挥关键作用,其屏障功能改变可通过增加炎症细胞浸润和血管水肿进而促进AAD的发生发展。尽管目前研究已明确了内皮屏障破坏是AAD发生发展的重要原因,但在此病理过程中,屏障功能改变如何被调控还需更深层的研究。乙醛脱氢酶2(Aldehyde dehydrogenase2,ALDH2)是乙醛脱氢酶超家族成员之一,在19种同工酶中活性最强,是人体内酒精(乙醇)代谢通路和多种内外源性醛类物质代谢的关键酶之一。该酶分布广泛,除肝以外,还丰富表达于心脏、肾脏、肺、脑等多种组织,在心脑血管疾病、肿瘤及神经退行性疾病的发生发展中均具有重要的病理生理意义。ALDH2基因至少有5个单核苷酸多态。其中,位于第12外显子的Glu504Lys多态性位点(rs671)广泛存在于中、日、韩等东亚人群,突变率高达30%-50%。该位点有两个等位基因:*504Glu(*1)、*504Lys(*2),在人群中基因型有3种情况,野生纯合型(ALDH2*1/*1),产生具有正常催化活性的酶;突变杂合型(ALDH2*1/*2),突变纯合型(ALDH2*2/*2),后两种基因型产生的酶催化活性与野生型比较,均显著下降。研究表明,ALDH2基因突变与高血压、动脉粥样硬化和血脂异常等密切相关,而这些均是AAD的危险因素。基于此,我们推测ALDH2可能是AAD发病机制中一个尚未被认识的关键因素。因此,结合当前国内外研究进展,我们拟通过临床和基础研究深入探讨ALDH2对AAD的影响,探究ALDH2是否通过调控平滑肌细胞表型转化影响AAD发生发展及是否通过调控内皮屏障延缓AAD早期进展。基于中国汉族ALDH2基因30%-50%的高突变率,本研究将对AAD,尤其是我国AAD的预防和治疗策略提供新的思路和方法以及重要科学依据。研究目的(1)明确ALDH2是否通过调控平滑肌细胞表型转化,从而影响AAD进展;(2)探究内皮细胞ALDH2是否通过调控内皮屏障功能,从而影响AAD早期进展;(3)明确ALDH2调控内皮屏障影响主动脉瘤早期的具体分子机制。研究方法第一部分:乙醛脱氢酶2调控平滑肌细胞表型转化在主动脉瘤/夹层中的作用及其机制研究1.1 AAD患者和对照患者临床资料、标本收集AAD纳入标准:经计算机断层扫描确诊AAD。排除标准:马凡综合征、Ehlers-Danlos综合征、二尖瓣主动脉瓣狭窄或反流、恶性肿瘤、妊娠及外伤患者。我们首先在本医院招募2015年12月至2019年6月期间就诊的203例AAD患者和203例对照组,病例与对照组的比例为1:1。此外,在广东省某医院招募2018年7月至2019年5月期间就诊的104名AAD患者和196名对照组,病例与对照组的比例为1:2。我们对AAD患者和对照组进行高血压匹配,以消除高血压对AAD的影响。所有对照个体均为来自同一地理区域的非AAD患者,并对年龄和性别进行了匹配。同时收集所有受试者的血液样本和临床信息资料用于后续分析处理。AAD组主动脉样本来自于本医院需接受开放手术修复的AAD患者,对照组样本来自于本医院的心脏移植供体。用Trizol提取人AAD中膜组织和对照样本总mRNA,由北京博奥晶典科技公司进行mRNA测序,随后对其差异基因进行富集分析。1.2动物模型的建立和分组(1)为了探究ALDH2对主动脉夹层的影响:给予4周龄雄性C57BL/6J小鼠饲喂β-氨基丙腈(3-aminopropionitrile fumarate,BAPN)加工饲料4周,构建胸主动脉夹层模型。设置以下4组:①生理盐水(Saline)+DMSO组;②Saline+Daidzin(ALDH2特异性抑制剂)组;③BAPN+DMSO组;④BAPN+Daidzin组。期间每天观察小鼠有无死亡情况,记录死亡数量和原因,相应时间点后小鼠给予安乐死。(2)为了探究ALDH2是否通过miR-31-5p调控AAD发生发展:给予8周龄雄性ApoE-/-小鼠提前28天注射平滑肌细胞特异性过表达miR-31-5p腺相关病毒(AAV2-miR-31-5p,剂量5 × 1011 vg),随后皮下埋泵[提前装入血管紧张素Ⅱ(Angiotensin Ⅱ,AngⅡ),泵速1000 ng/kg/分钟]处理,并全程给予高脂饲料喂养,构建腹主动脉瘤模型。期间,2天/次腹腔注射Daidzin(剂量75 mg/kg)药物。设置以下4组:①AAV2-scramble+DMSO;②AAV2-scramble+Daidzin;③AAV2-miR-31-5p+DMSO;④AAV2-miR-31-5p+Daidzin。期间每天观察小鼠有无死亡情况,记录死亡数量和原因,相应时间点后小鼠给予安乐死。1.3人和小鼠主动脉平滑肌细胞的提取及鉴定为了获得人/小鼠原代血管平滑肌细胞,用冷PBS冲洗人/小鼠主动脉组织3-4次。然后轻轻去除内膜和外膜,将组织切成1-2毫米的组织块。随后用0.25%的Ⅱ型胶原酶和0.5%的Ⅱ型弹性蛋白酶37℃处理1小时。在细胞培养箱中培养瓶先正放半个小时,然后倒放一个小时使组织块贴壁更为牢固,最后加入培养基。待细胞培养至4～6代可用于实验。α-SMA免疫荧光染色用于鉴定平滑肌细胞是否提取成功。1.4细胞模型的建立和分组分别培养人主动脉原代平滑肌细胞(Primary Human Vascular Smooth Muscle Cells,HVSMCs)和鼠主动脉原代平滑肌细胞(Primary Mouse Vascular Smooth Muscle Cells,MVSMCs)于含10%胎牛血清(Foetal Bovine Serum,FBS)的VSMC培养基和高糖培养基中,在含5%CO2的37℃孵箱中增殖。主要处理见下:(1)提前半小时给予细胞DMSO(Control)和Daidzin刺激,然后给予Ang Ⅱ刺激24小时,设置以下4组:①Control+Saine;②Control+AngⅡ;③Daidzin+Saline;④Daidzin+Ang Ⅱ。(2)提取人ALDH2野生型(Wild Type,WT)和突变型(Mutant)原代平滑肌细胞,然后给予Ang Ⅱ刺激24小时,设置以下4组:①WT+Saline;②WT+Ang Ⅱ;③Mutant+Saline;④Mutant+Ang Ⅱ。第二部分:乙醛脱氢酶2调控内皮屏障对主动脉瘤早期的影响2.1动物模型的建立和分组(1)为了探究在AAD早期进展中,ALDH2及内皮屏障功能指标的表达变化:给予8周龄雄性ApoE-/-小鼠皮下埋泵(泵速1000 ng/kg/分钟)处理,并全程给予高脂饲料喂养,构建腹主动脉瘤模型。设置以下3组:①生理盐水(Saline)组;②Ang Ⅱ处理3天;③AngⅡ处理28天。期间每天观察小鼠有无死亡情况,记录死亡数量和原因,相应时间点后小鼠给予安乐死。(2)为了探究内皮细胞条件性敲除ALDH2对AAD的影响:将ALDH2flox小鼠与Tek-creERT2小鼠杂交得到ALDH2ECKO小鼠。给8周龄雄性ALDH2flox小鼠和ALDH2ECKO小www.selleck.cn/products/abt-199鼠提前14天尾静脉注射腺相关病毒(AAV8-Mpcsk9D377Y,剂量2 × 1011 vg),随后皮下埋泵(泵速1000 ng/kg/分钟)处理28天,并全程给予高脂饲料喂养,构建腹主动脉瘤模型。设置以下4组:①ALDH2flox+Saline;②ALDH2flox+Ang Ⅱ;③ALDH2ECKO+Saline;④ALDH2ECKO+AngⅡ。期间每天观察小鼠有无死亡情况,记录死亡数量和原因,相应时间点后小鼠给予安乐死。(3)为了探究内皮细胞特异性敲低ALDH2对AAD的影响:给予8周龄雄性ApoE-/-小鼠提前28天注射内皮细胞特异性敲低ALDH2腺相关病毒(AAV1-shALDH2,剂量5 × 1011 vg),随后皮下埋泵(泵速1000 ng/kg/分钟)处理,并全程给予高脂饲料喂养,构建腹主动脉瘤模型。设置以下2组:①AAV1-scramble+Ang Ⅱ;②AAV1-shALDH2+AngⅡ。期间每天观察小鼠有无死亡情况,记录死亡数量和原因,相应时间点后小鼠给予安乐死。(4)为了探究ALDH2对内皮屏障功能的影响:给8周龄雄性野生型(WT)小鼠和ALDH2-/-小鼠皮下埋泵(泵速700ng/kg/分钟)处理14天,全程给予普通饲料喂养,构建内皮损伤模型。设置以下4组:①WT+Saline;②WT+AngⅡ;③ALDH2-/-+Saline;④ALDH2-/-+Ang Ⅱ。期间每天观察小鼠有无死亡情况,记录死亡数量和原因,14天后小鼠给予安乐死。此外,给8周龄雄性ApoE-/-小鼠和ApoE-/-ALDH2-/-(DKO)小鼠皮下埋泵(泵速1000 ng/kg/分钟)处理28天,并全程给予高脂饲料喂养,构建腹主动脉瘤模型。设置以下 4 组:①ApoE-/-+Saline;②ApoE-/-+AngⅡ;③DKO+Saline;④DKO+AngⅡ。期间每天观察小鼠有无死亡情况,记录死亡数量和原因,相应时间点后小鼠给予安乐死。2.2血管通透性检测在Ang Ⅱ处理实验终点,通过尾静脉注射Evans blue染料(100 μL,1%)。待染料循环1小时后,迅速分离小鼠主动脉,进行OCT包埋和冰冻切片,共聚焦显微镜下观察染料在主动脉横截面中的分布情况。2.3小鼠主动脉血管单细胞测序取AngⅡ干预后第0、3、28天的ApoE-/-小鼠主动脉进行酶解,制备单细胞悬液,并检测单细胞活率,进行单细胞mRNA测序。对内皮细胞中差异基因进行富集分析,观察内皮屏障相关调控通路表达变化。2.4细胞模型的建立和分组培养人主动脉原代内皮细胞(Primary Human Aortic Endothelial Cells,HAECs)于 10%FBS的ECM培养基中,在含5%CO2的37℃孵箱中增殖。主要处理见下:(1)时间梯度实验:选用l0-6M Ang Ⅱ别刺激HAECs细胞12小时,24小时,48小时,收集细胞。(2)浓度梯度实验:分别选用 0,10-8M,10-7M,10-6M,10-5M,10-4M 的 AngⅡ刺激HAECs细胞24小时,收集细胞。(3)分别转染shALDH2和GFP(对照)的病毒,然后给予Ang Ⅱ刺激24小时,设置以下 4 组:Ⅱ①Scramble+Saline;②Scramble+Ang Ⅱ;③shALDH2+Saline;④shALDH2+Ang Ⅱ。2.5细胞间通透性检测在共培养皿上室内培养人主动脉内皮细胞,给予AngⅡ刺激,内皮细胞形成单层后,加入FITC-右旋糖酐荧光染料,每隔30分钟检测下室培养基内FITC-右旋糖酐荧光强度,评价内皮细胞间通透性变化情况。第三部分:乙醛脱氧酶2调控内皮屏障影响主动脉瘤早期的机制研究3.1动物模型的构建和分组(1)为了明确转录因子ELK3是ALDH2调控腹主动脉瘤的关键环节:将shELK3序列克隆到pAV-ICAM2-GFP-mir30-shRNA中,得到内皮细胞特异性ELK3干扰腺相关病毒(AAV1-shELK3)。给8周龄雄性ApoE-/-小鼠和DKO小鼠提前28天注射AAV1-shELK3(剂量5 × 1011 vg),随后皮下埋泵(泵速1000ng/kg/分钟)处理28天,并全程给予高脂饲料喂养,构建腹主动脉瘤模型。设置以下3组:①ApoE-/-+AAVl-scramble+AngⅡ;②DKO+AAV1-scramble+AngⅡ;③DKO+AAV1-shELK3+Ang II。期间每天观察小鼠有无死亡情况,记录死亡数量和原因,28天后小鼠给予安乐死。(2)为了明确转录因子ELK3是ALDH2调控腹主动脉瘤早期进展的关键环节:将ELK3序列克隆到pAV-ICAM2-P2A-GFP中,得到内皮细胞特异性ELK3过表达腺相关病毒(AAV1-ELK3)。给8周龄雄性ApoE-/-小鼠和DKO小鼠提前28天注射AAV1-ELK3(剂量5 × 1011 vg),随后皮下埋泵(泵速1000 ng/kg/分钟)处理7天,并全程给予高脂饲料喂养,构建腹主动脉瘤模型。设置以下2组:①ApoE-/-+AAV1-ELK3+AngⅡ;②DKO+AAV1-ELK3+Ang Ⅱ。期间每天观察小鼠有无死亡情况,记录死亡数量和原因,相应时间点后小鼠给予安乐死。3.2细胞模型建立和分组培养人脐静脉内皮细胞系(Human Umbilical Vein Endothelial Cells,HUVECs)和人胚肾细胞(HEK-293T),分别培养在含10%FBS的RPMI1640和高糖DMEM培养基中,于含5%CO2的37℃孵箱中增殖。根据不同处理方式进行分组。(1)人脐静脉内皮细胞系(HUVECs)处理1)体外培养HUVECs细胞,给予10-6MAngⅡ刺激24小时,收集细胞,RT-qPCR观察调控内皮屏障相关指标的转录因子表达情况;2)体外培养HUVECs细胞,利用RNAiMAX转染细胞ELK3、TEAD1、FOS的小干扰RNA敲减其表达,收集细胞,RT-qPCR观察内皮屏障相关指标表达情况;3)体外培养HUVECs细胞,利用Lipo3000转染细胞ELK3质粒,进行双荧光素酶报告实验和染色质免疫共沉淀(Chromatinimmunoprecipitation,ChIP)实验,观察ELK3对内皮屏障相关指标转录的影响;4)体外培养HUVECs细胞,利用RNAiMAX转染细胞ELK3小干扰敲减ELK3表达,同时转染shALDH2慢病毒敲减ALDH2表达,给予10-6 M Ang Ⅱ刺激24小时,收集细胞,RT-qPCR观察内皮屏障相关指标表达情况;5)体外培养HUVECs细胞,利用RNAiMAX转染细胞LIN28B的小干扰RNA敲减其表达,收集细胞,RT-qPCR和western blot观察ELK3和内皮屏障相关指标的表达情况。(2)人胚肾细胞(HEK-293T)处理构建带Flag标签的ALDH2过表达质粒和带HA标签的LIN28B过表达质粒,利用Lipo3000转染试剂共转染体外培养的HEK-293T细胞,进行免疫共沉淀(Co-immunoprecipitation,Co-IP)和免疫荧光实验,观察ALDH2和LIN28B结合情况。3.3激光共聚焦检测ALDH2和LIN28B的共定位将带Flag标签的ALDH2过表达质粒和带HA标签的LIN28B过表达质粒共转染HEK293T细胞系,细胞免疫荧光染色后,利用激光共聚焦显微镜检测ALDH2和LIN28B在细胞内的共定位情况。3.4 Co-IP 实验体外培养人脐静脉内皮细胞,利用内源性抗体进行Co-IP检测内源性目的分子的结合情况。体外培养HEK293T细胞,构建各种目的分子的过表达质粒转染细胞,利用标签抗体进行Co-IP检测外源性目的分子的结合情况。3.5 RNA 免疫沉淀反应(RNA immunoprecipitation,RIP)实验体外培养HUVECs细胞,利用RNA免疫共沉淀试剂盒检测与目的蛋白结合的mRNA表达情况。统计学分析为研究ALDH2基因型与AAD风险的关系,采用logistic回归方法计算优势比(OR)及其95%可信区间(95%CI)。连续变量以均值±标准差表示,分类变量以数量和百分比(%)表示。采用Shapiro-Wilks检验进行数据分布的正态性假设评估。采用Brown-Forsythe检验进行正态分布数据间方差齐性检验。采用非配对t检验分析两组间数据统计差异,采用单因素方差分析多组间数据统计差异。非参数检验用于非正态分布或样本量小的数据。两组间比较采用Mann-Whitney检验,两组以上比较采用Kruskal-Wallis检验和Dunn’s多重比较检验。P<0.05被视为具有统计学差异。所有实验至少重复3次。使用GraphPad Prism 8.0版本进行数据分析。研究结果第一部分:乙醛脱氢酶2调控平滑肌细胞表型转化在主动脉瘤/夹层中的作用及其机制研究1.1 ALDH2基因突变与AAD患病率呈负相关我们首先在本医院开展了前瞻性的病例对照研究,在校正了包括高血压、年龄、性别、吸烟、冠心病、高脂血症等常规危险因素后,发现与ALDH2基因野生型(GG)相比,ALDH2基因突变型(GA/AA)携带者主动脉夹层/瘤发病风险显著降低50.4%(OR=0.496,95%CI 0.256～0.958,p=0.037)。之后在广东开展了另一项独立的病例对照研究,发现与ALDH2基因野生型(GG)相比,ALDH2基因突变型(GA/AA)携带者主动脉夹层/瘤发病风险显著降低43.5%(OR=0.565,95%CI 0.346～0.919,p=0.025)。这些结果显示,ALDH2基因突变可显著降低AAD的发病风险。1.2抑制ALDH2活性显著降低小鼠AAD发病率BAPN加工饲料处理前后各组小鼠收缩压无统计学差异,但BAPN加工饲料处理的小鼠舒张压低于正常饲料处理组。与对照组相比,抑制ALDH2活性减轻BAPN诱导的小鼠胸主动脉的扩张程度,减少小鼠胸主动脉夹层形成,提高小鼠生存率,减缓BAPN诱导的血管病理变化。而激活或过表达ALDH2对小鼠动脉夹层发生发展无明显影响。1.3 ALDH2基因缺乏通过激活myocardin,抑制平滑肌细胞表型转化,对AAD发挥保护作用通过对3例主动脉夹层患者及其3例对应健康对照组的血管进行mRNA测序,结果显示主动脉夹层患者血管中有1894个基因下调,这些基因主要调控血管结构发育、细胞外基质和肌肉收缩等生物学功能。而维持血管平滑肌细胞收缩表型的基因下调尤为明显,这表明平滑肌细胞表型转化在疾病发生发展过程中起着重要作用。鉴于myocardin在平滑肌细胞稳态中的关键作用,我们对ALDH2基因敲除小鼠和野生型小鼠的主动脉组织中myocardin相关基因进行GO富集分析,结果显示,与ALDH2野生型相比,ALDH2基因敲除组α-SMA和SM22-α基因表达显著增高。以上结果表明,ALDH2基因缺乏可能通过激活myocardin,抑制平滑肌细胞表型转化,对AAD发挥保护作用。1.4 ALDH2基因缺乏可通过下调miR-31-5p的表达,抑制AAD进展超声结果显示,与对照组相比,AAV2-miR-31-5p增加小鼠主动脉的扩张程度。大体和超声结果显示,AAV2-miR-31-5p造成小鼠动脉瘤发生率和死亡率增加。RT-qPCR和western blot结果均显示,AAV2-miR-31-5p下调myocardin表达水平。而抑制ALDH2活性可改善上述情况,发挥血管保护作用,减少小鼠动脉瘤发生率,提高小鼠生存率。1.5 ALDH2基因缺乏可通过上调Max的表达,抑制miR-31-5p水平生信分析预测发现,miR-31-5p启动子区域存在两个潜在的Max结合位点。双荧光素酶报告实验结果显示,转录因子Max明显抑制野生型miR-31-5p转录活性,而对突变型miR-31-5p转录活性无影响。提取ALDH2野生型和ALDH2基因敲除小鼠平滑肌细胞,进行AngⅡ刺激,发现ALDH2基因敲除后Max水平显著增加。使用Max干扰RNA敲减Max表达后,miR-31-5p表达显著上调。以上结果表明,ALDH2基因缺乏可通过上调Max的表达,抑制miR-31-5p水平。1.6 ALDH2-miR-31-5p-myocardin 轴调控人 VSMCs 的表型转换提取人原代血管平滑肌细胞进行实验,RT-qPCR结果显示,AngⅡ处理24小时后,miR-31-5p表达增加,myocardin和平滑肌Blood-based biomarkers细胞收缩型标志物α-SMA、SM22-α和Calponin表达显著降低。与ALDH2野生型相比,ALDH2突变型平滑肌细胞可改善Ang Ⅱ导致的上述变化。第二部分:乙醛脱氢酶2调控内皮屏障对主动脉瘤早期的影响2.1 AAD患者主动脉内皮屏障功能受损对3例对照与6例AAD患者的主动脉内膜进行了 Bulk mRNA测序,结果显示,与对照组相比,AAD患者主动脉内膜中Focal adhesion相关通路显著下调,位居第五位;RT-qPCR结果显示,与对照组相比,AAD患者主动脉内膜组织中内皮屏障相关指标表达显著降低。2.2 AAD小鼠在动脉瘤早期内皮屏障功能受损通过对Ang Ⅱ干预后第0、3、28天的ApoE-/-小鼠主动脉组织进行单细胞测序,描绘了小鼠AAD不同进展过程中基因表达的动态变化图谱,并对内皮细胞中差异基因进行了 GO富集分析,结果显示,与对照组(0天)相比,AngⅡ干预第3天和第28天小鼠主动脉内皮细胞中Focal adhesion相关通路均显著下调。这些结果表明,内皮屏障功能受损是AAD进展的早期事件。2.3 ALDH2在主动脉瘤/夹层组织中表达上调对AAD患者和对照组主动脉组织进行了免疫组化和免疫印迹实验,结果显示,与对照组相比,ALDH2在AAD患者主动脉内膜和中膜中表达均显著上调。2.4内皮细胞特异性敲除/敲低ALDH2抑制小鼠腹主动脉瘤发生将ALDH2flox小鼠与Tek-creERT2小鼠杂交得到ALDH2ECKO小鼠,并进行小鼠腹主动脉瘤模型的构建。结果显示,与对照组相比,内皮细胞特异性敲除ALDH2可降低小鼠腹主动脉成瘤率和死亡率,减轻小鼠主动脉血管扩张程度,改善了 AngⅡ诱导的血管组织病理变化。AAV作为基因治疗中最常用的病毒载体之一,因其稳定、高效、无细胞毒性的特性,在基因治疗中具有广泛应用前景。我们构建了内皮细胞特异性敲低ALDH2腺相关病毒,并进行小鼠腹主动脉瘤模型的构建。结果显示,与对照组相比,内皮细胞特异性敲低ALDH2可降低小鼠腹主动脉成瘤率,减轻小鼠主动脉血管扩张程度,改善了 Ang Ⅱ诱导的血管组织病理变化。2.5 ALDH2基因敲除/敲低保护内皮屏障功能AngⅡ 刺激后,内皮屏障指标 JAM-A、VE-cadherin、p120-cadherin 和 Claudin5 表达显著下调,Vinculin反应性上调,而ALDH2基因敲除/敲低可改善上述指标变化。2.6内皮细胞特异性敲低ALDH2可通过保护内皮屏障功能,减轻小鼠主动脉早期扩张程度结果显示,与对照组相比,内皮细胞特异性敲低ALDH2可明显上调内皮屏障相关指标的水平,抑制主动脉早期扩张程度,改善AngⅡ诱导的血管组织病理变化。第三部分:乙醛脱氧酶 2调控内皮屏障影响主动脉瘤早期的机制研究3.1转录因子ELK3促进内皮屏障功能使用小干扰RNA抑制ELK3表达,内皮屏障指标Vinculin、JAM-A、Claudin5、VE-cadherin和p120-cadherin表达显著下调。荧光素酶报告基因结果显示,ELK3促进JAM-A、Claudin5和VE-cadherin的转录。ChIP结果显示,过表达ELK3增加了其与Claudin5启动子的结合。3.2.ALDH2通过转录因子ELK3调控内皮屏障功能在AnNavitoclax IC50gⅡ处理的人脐静脉内皮细胞中,使用小干扰抑制ELK3表达后,内皮屏障相关指标 Vinculin、JAM-A、Claudin5、VE-cadherin 和 P120-catenin 的表达显著下调,而敲减ALDH2后可改善上述变化。3.3 ALDH2 促进 ELK3 mRNA 降解RT-qPCR结果显示,敲除ALDH2可增强ELK3 mRNA水平。荧光素酶报告基因实验结果显示,ALDH2对ELK3转录无明显影响。接下来,使用放线菌素D抑制基因转录,发现与对照组相比,过表达ALDH2加快了 ELK3 mRNA降解速率,导致ELK3 mRNA稳定性降低。3.4 LIN28B 稳定 ELK3 mRNA蛋白质谱实验和Co-IP结果显示,LIN28B可以与真核翻译起始因子、延伸因子、RNA解旋酶A等直接结合,从而调控目标mRNA的转录和翻译。使用小干扰RNA干扰LIN28B表达后,ELK3的mRNA和蛋白水平显著降低。使用放线菌素D抑制基因转录,发现与对照组相比,干扰LIN28B后ELK3 mRNA稳定性降低。3.5 ALDH2直接结合LIN28B,降低ELK3 mRNA稳定性Hdock预测结果显示ALDH2与LIN28B可能存在直接结合。Co-IP和免疫荧光实验证实了这一发现。为了进一步明确ALDH2-LIN28B在调节内皮屏障功能中的作用,我们进行了 RIP实验,结果显示,ALDH2可拮抗ELK3 mRNA与LIN28B的结合。在ALDH2敲减的HAECs中,使用了小干扰下调LIN28B水平,western blot和免疫荧光结果显示,敲减ALDH2可上调内皮屏障相关指标变化,而干扰LIN28B后内皮屏障指标表达显著下调,敲减ALDH2的保护作用消失。3.6内皮细胞特异性敲低ELK3促进小鼠腹主动脉瘤发生发展构建内皮细胞特异性敲低ELK3腺相关病毒,并进行小鼠腹主动脉瘤模型的构建。结果显示,与对照组相比,内皮细胞特异性敲低ELK3显著增加小鼠腹主动脉成瘤率和主动脉最大扩张程度,明显加重Ang Ⅱ诱导的血管组织病理变化。3.7内皮细胞特异性过表达ELK3抑制小鼠腹主动脉瘤早期进展构建了内皮细胞特异性过表达ELK3腺相关病毒,并进行小鼠腹主动脉瘤早期模型的构建。在实验早期对小鼠进行取材,结果显示,与对照组相比,内皮细胞特异性过表达ELK3可改善Ang Ⅱ导致的主动脉早期扩张程度和血管组织病理变化。研究结论1.ALDH2基因突变降低AAD发病风险;2.ALDH2基因突变可上调myocardin表达,维持平滑肌细胞收缩表型,对AAD发挥保护作用;3.内皮特异性ALDH2敲除/敲低可保护内皮屏障功能,抑制AAD早期扩张。
FeS_2/MnFe_2O_4复合材料的制备及活化PMS降解2,4二氯苯酚的效能与机制研究
2,4二氯苯酚(2,4-DCP)被广泛应用在众多行业中,例如医药、农业、纺织、造纸等。但由于生产损失、意外泄漏、工业废水排放等原因,大量的2,4-DCP进入自然环境中。其理化性质十分稳定,具有生物富集性和难降解的特性,导致人类癌症、畸形和基因突变等严重健康问题,同时对自然生态环境也带来了严重威胁。常规的处理方法很难将2,4-DCP完全降解,因此研究如何高效降解2,4-DCP对保障居民供水安全和生态环境健康具有重要意义。基于过一硫酸盐(PMS)的高级氧化技术是去除难降解有机污染物最为高效的方法之一,其中双金属氧化物Mn Fe_2O_4是一种经济绿色的PMS活化剂。然而,Fe(Ⅱ)和Mn(Ⅱ)在活化PMIndirect genetic effectsS过程中被氧化为Fe(Ⅲ)和Mn(Ⅲ),但高价金属离子活化效果较差,同时低价金属离子再生困难,导致体系的降解性能差。因此如何促进Fe(Ⅲ)、Mn(Ⅲ)向Fe(Ⅱ)、Mn(Ⅱ)转化,加速低价金属离子再生,对增强体系的降解性能有重要的意义。本文致力于研究一种基于Mn Fe_2O_4的PMS活化材料,使其降解2,4-DCP有快速高效的特点。由于硫具有高还原性,有利于促进低价金属离子再生,本文通过两步水热法制备了一种新型纳米复合材料——FeS_2/Mn Fe_2O_4,作为PMS活化剂用于降解2,4-DCP。分别从材料的制备条件优化及表征、催化性能评估、机理研究三方面来探究FeS_2/Mn Fe_2O_4的性能。主要研究成果如下:(1)选取了三种常见的硫化复合物的制备方法进行尝试,确定两步水热法可成功制备FeS_2/Mn Fe_2O_4。选取水热合成过程中的四个影响因素对产物进行优化,最终确定:最佳溶剂为纯乙二醇,金属盐为Fe Cl_3和Mn(CH_3COOH)_2,最佳水热温度为140℃,最佳水热时间为9 h。通过XRD、EDS图谱分析其物相及元素组成,证明成功制备出FeS_2/Mn Fe_2O_4复合材料。通过SEM图像分析,FeS_2/Mn Fe_2O_4具有不规则形状的片状结构。通过XPS、FT-IR、Raman分析,发现FeS_2/Mn Fe_2O_4中确存在着硫化物和金属氧的特征峰形,进一步明确其结构。通过电化学测试,发现相比于Mn Fe_2O_4,FeS_2/Mn Fe_2O_4有更大的电子转移速率,氧化还原能力更强。(2)对FeS_2/Mn Fe_2O_4/PMS体系降解性能和影响因素研究发现:本研究的体系在15分钟时对2,4-DCP的降解率达到了90.4%,比体系Mn Fe_2O_4/PMS的降解率提高了48.4%。k_(obs)为0.1375 min~GSI-IX作用(-1),是体系Mn Fe_2O_4/PMS(0.0188 min~(-1))的7.31倍,说明负载以后显著提高了催化剂的性能。与其他类型的芬顿类催化剂相比,FeS_2/Mn Fe_2O_4的催化性能亦有明显的优势。当FeS_2/Mn Fe_2O_4浓度为1.5 g/L,2,4-DCP浓度为100 mg/L,PMS浓度为5 m M,且不对溶液的初始p H值进行调整时,此条件下FeS_2/Mn Fe_2O_4/PMS体系对2,4-DCP的降解效果最优。不同浓度的腐殖酸和四种常见的无机阴离子对FeS_2/Mn Fe_2O_4/PMS体系影响很小,此外该体系对不同类型的污染物都有良好的去除效果。FeS_2/Mn Fe_2O_4在三次回收后体系对2,4-DCP的降解仍可达到77.9%。结果表明,FeS_2/Mn Fe_2O_4具有极为优异的催化性能,且表现出了良好的稳定性及循环利用性。(3)FeS_2/Mn Fe_2O_4BMN 673研究购买/PMS体系降解2,4-DCP过程中,~1O_2和O_2~(·-)起到了主要作用,SO_4~(·-)和OH引导的为辅助降解途径。通过监测反应过程中溶液的TOC值变化,发现体系对2,4-DCP有良好的矿化度,说明大部分2,4-DCP在被氧化的同时也被矿化为CO_2和H_2O。对中间产物进行分析鉴定,提出了三种可能的降解路径,对中间体的毒性进行预测,发现整体的毒性要小于2,4-DCP。结果表明,由于铁和锰之间的协同作用以及硫的还原能力加速了Fe(Ⅱ)/Fe(Ⅲ)和Mn(Ⅱ)/Mn(Ⅲ)的循环,负载硫化物以后解决了催化剂中低价金属离子再生的问题,极大的提高了催化活性。
FeS_2/MnFe_2O_4复合材料的制备及活化PMS降解2,4二氯苯酚的效能与机制研究
2,4二氯苯酚(2,4-DCP)被广泛应用在众多行业中,例如医药、农业、纺织、造纸等。但由于生产损失、意外泄漏、工业废水排放等原因,大量的2,4-DCP进入自然环境中。其理化性质十分稳定,具有生物富集性和难降解的特性,导致人类癌症、畸形和基因突变等严重健康问题,同时对自然生态环境也带来了严重威胁。常规的处理方法很难将2,4-DCP完全降解,因此研究如何高效降解2,4-DCP对保障居民供水安全和生态环境健康具有重要意义。基于过一硫酸盐(PMS)的高级氧化技术是去除难降解有机污染物最为高效的方法之一,其中双金属氧化物Mn Fe_2O_4是一种经济绿色的PMS活化剂。然而,Fe(Ⅱ)和Mn(Ⅱ)在活化PMIndirect genetic effectsS过程中被氧化为Fe(Ⅲ)和Mn(Ⅲ),但高价金属离子活化效果较差,同时低价金属离子再生困难,导致体系的降解性能差。因此如何促进Fe(Ⅲ)、Mn(Ⅲ)向Fe(Ⅱ)、Mn(Ⅱ)转化,加速低价金属离子再生,对增强体系的降解性能有重要的意义。本文致力于研究一种基于Mn Fe_2O_4的PMS活化材料,使其降解2,4-DCP有快速高效的特点。由于硫具有高还原性,有利于促进低价金属离子再生,本文通过两步水热法制备了一种新型纳米复合材料——FeS_2/Mn Fe_2O_4,作为PMS活化剂用于降解2,4-DCP。分别从材料的制备条件优化及表征、催化性能评估、机理研究三方面来探究FeS_2/Mn Fe_2O_4的性能。主要研究成果如下:(1)选取了三种常见的硫化复合物的制备方法进行尝试,确定两步水热法可成功制备FeS_2/Mn Fe_2O_4。选取水热合成过程中的四个影响因素对产物进行优化,最终确定:最佳溶剂为纯乙二醇,金属盐为Fe Cl_3和Mn(CH_3COOH)_2,最佳水热温度为140℃,最佳水热时间为9 h。通过XRD、EDS图谱分析其物相及元素组成,证明成功制备出FeS_2/Mn Fe_2O_4复合材料。通过SEM图像分析,FeS_2/Mn Fe_2O_4具有不规则形状的片状结构。通过XPS、FT-IR、Raman分析,发现FeS_2/Mn Fe_2O_4中确存在着硫化物和金属氧的特征峰形,进一步明确其结构。通过电化学测试,发现相比于Mn Fe_2O_4,FeS_2/Mn Fe_2O_4有更大的电子转移速率,氧化还原能力更强。(2)对FeS_2/Mn Fe_2O_4/PMS体系降解性能和影响因素研究发现:本研究的体系在15分钟时对2,4-DCP的降解率达到了90.4%,比体系Mn Fe_2O_4/PMS的降解率提高了48.4%。k_(obs)为0.1375 min~GSI-IX作用(-1),是体系Mn Fe_2O_4/PMS(0.0188 min~(-1))的7.31倍,说明负载以后显著提高了催化剂的性能。与其他类型的芬顿类催化剂相比,FeS_2/Mn Fe_2O_4的催化性能亦有明显的优势。当FeS_2/Mn Fe_2O_4浓度为1.5 g/L,2,4-DCP浓度为100 mg/L,PMS浓度为5 m M,且不对溶液的初始p H值进行调整时,此条件下FeS_2/Mn Fe_2O_4/PMS体系对2,4-DCP的降解效果最优。不同浓度的腐殖酸和四种常见的无机阴离子对FeS_2/Mn Fe_2O_4/PMS体系影响很小,此外该体系对不同类型的污染物都有良好的去除效果。FeS_2/Mn Fe_2O_4在三次回收后体系对2,4-DCP的降解仍可达到77.9%。结果表明,FeS_2/Mn Fe_2O_4具有极为优异的催化性能,且表现出了良好的稳定性及循环利用性。(3)FeS_2/Mn Fe_2O_4BMN 673研究购买/PMS体系降解2,4-DCP过程中,~1O_2和O_2~(·-)起到了主要作用,SO_4~(·-)和OH引导的为辅助降解途径。通过监测反应过程中溶液的TOC值变化,发现体系对2,4-DCP有良好的矿化度,说明大部分2,4-DCP在被氧化的同时也被矿化为CO_2和H_2O。对中间产物进行分析鉴定,提出了三种可能的降解路径,对中间体的毒性进行预测,发现整体的毒性要小于2,4-DCP。结果表明,由于铁和锰之间的协同作用以及硫的还原能力加速了Fe(Ⅱ)/Fe(Ⅲ)和Mn(Ⅱ)/Mn(Ⅲ)的循环,负载硫化物以后解决了催化剂中低价金属离子再生的问题,极大的提高了催化活性。
六价铬通过铁自噬介导的铁死亡致小鼠睾丸支持细胞损伤的研究
目的:六价铬[Cr(Ⅵ)]是一种环境重金属污染物,能影响雄性生殖功能,对睾丸造成损伤,但是其具体机制尚未阐明。支持细胞是Cr(Ⅵ)导致睾丸损伤的靶细胞之一。本研究通过建立Cr(Ⅵ)致小鼠睾丸支持细胞TM4细胞系损伤模型,观察Cr(Ⅵ)对TM4细胞的毒性作用,并进一步探讨铁死亡、自噬、铁自噬在Cr(Ⅵ)致TM4细胞损伤中的作用及其机制。方法:睾丸支持细胞TM4细胞系培养和传代,CCK-8法检测1.25-40μM Cr(Ⅵ)作用12、24和48 h对细胞活力的影响;透射电镜观察细胞超微结构变化;DCFHDA探针检测细胞ROS水平;试剂盒检测细胞内GSH和MDimmunity effectA含量的变化以及总铁含量的变化;Western blot法检测血睾屏障相关蛋白CX43、ZO-1,铁死亡相关蛋白FPN1、Tf R1、SLC7A11、GPX4,自噬相关蛋白LC3B、P62、BECLIN1,和铁自噬相关蛋白NCOA4、FTH1的表达。TM4细胞给予5μM Cr(Ⅵ)染毒同时给予铁死亡抑制剂Ferrostatin-1,检测细胞活力、ROS水平和铁死亡相关蛋白的表达。TM4细胞给予5μM Cr(Ⅵ)染毒同时给予自噬抑制剂3-MA,检测细胞活力、ROS水平以及自噬、铁自噬和铁死亡相关蛋白的表达。siRNA沉默NCOA4基因后,检测siRNA沉默效率,给予5μM Cr(Ⅵ)染毒,检测ROS水平以及铁死亡和铁自噬相关蛋白的表达。结果:1.Cr(Ⅵ)对TM4细胞的损伤作用:TM4细胞存活率随Cr(Ⅵ)染毒时间和剂量的增加而下降。电镜结果显示对照组细胞结构正常而Cr(Ⅵ)染毒组出现自噬小体和自噬溶酶体,线粒体膜密度增高、嵴减少。Western blot法结果显示,血睾屏障相关蛋白ZO-1和CX43蛋白表达随着染毒剂量增加而下降,染毒组显著低于对照组(P<0.05)。2.Cr(Ⅵ)诱导TM4细胞铁死亡的发生:试剂盒检测结果表明TM4细胞内GSH含量随Cr(Ⅵ)染毒剂量增高而下降,MDA含量、ROS水平、总铁含量随Cr(Ⅵ)染毒剂量增高而上升;与对照组相比,5μM和10μM组有显著性差异(P<0.05)。铁稳态和铁死亡相关蛋白Tf R1表达随着染毒剂量增加而升高,5μM和10μM组显著高于对照组(P<0.Telaglenastat核磁05);FPN1和GPX4蛋白表达随着染毒剂量增加而降低,染毒组显著低于对照组(P<0.05);SLC7A11蛋白表达仅在10μΜ组显著低于对照组(P<0.05)。3.抑制铁死亡可减轻Cr(Ⅵ)诱导的TM4细胞损伤:与Cr(Ⅵ)单独染毒组相比,铁死亡抑制剂Fer-1与Cr(Ⅵ)联合处理后细胞活力显著升高(P<0.05),CDK抑制剂ROS水平显著降低(P<0.05),GPX4蛋白表达显著升高(P<0.05),Tf R1蛋白表达显著降低(P<0.05)。4.铁自噬在Cr(Ⅵ)暴露对TM4细胞损伤中的作用:自噬相关蛋白LC3B II/I比值和BECLIN1表达随着染毒剂量增加而上升,5μM和10μM组显著高于对照组(P<0.05);P62蛋白表达随着染毒剂量增加而下降,5μM和10μM组显著低于对照组(P<0.05)铁蛋白吞噬的相关蛋白NCOA4蛋白表达随着染毒剂量增加而上升。与对照组相比,5μM、10μM组蛋白表达有显著性差异(P<0.05));而FTH1蛋白表达随着染毒剂量增加而下降,与对照组相比,5μM、10μM组蛋白表达有显著性差异(P<0.05)。5.抑制自噬可减轻Cr(Ⅵ)致TM4细胞铁死亡的发生:与Cr(Ⅵ)单独染毒组相比,与Cr(Ⅵ)单独染毒组相比,自噬抑制剂3-MA与Cr(Ⅵ)联合处理后细胞活力显著上升(P<0.05),ROS水平显著降低(P<0.05),NCOA4蛋白表达以及LC3B II/I蛋白比值显著下降(P<0.05),而P62、GPX4和FTH1蛋白表达显著升高(P<0.05)。6.NCOA4介导的铁自噬在Cr(Ⅵ)暴露TM4细胞铁死亡中的作用:NCOA4基因沉默后,与Cr(Ⅵ)单独染毒组相比,ROS水平显著降低(P<0.05),NCOA4和Tf R1蛋白表达显著降低(P<0.05),而FTH1和GPX4蛋白表达显著升高(P<0.05)。结论:1.Cr(Ⅵ)能够造成TM4细胞损伤。2.Cr(Ⅵ)通过铁死亡导致TM4细胞损伤;铁死亡抑制剂Fer-1处理后,减少Cr(Ⅵ)致TM4细胞铁死亡的发生。3.Cr(Ⅵ)通过铁自噬介导的铁死亡导致TM4细胞损伤。3-MA以及siRNA沉默NCOA4基因抑制铁自噬后,减少Cr(Ⅵ)致TM4细胞铁自噬介导的铁死亡的发生。