研究目的:肌少症(Sarcopenia)是一种渐进性、广泛存在的骨骼肌疾病,表现为肌肉质量和功能的加速丧失,增加跌倒、患老年性疾病等风险。尤其是在我国老龄化程度加剧的社会背景下,阐明肌少症发病机制,采取有效的预防策略,是延缓衰老进程,促进老年人健康首要关注的问题。近年有越来越多的研究表明肌少症发生与肌细胞内铁过载引发的铁死亡(ferroptosis)有关。铁死亡是一种铁依赖的程序性细胞死亡,主要特征是线粒体体积缩小、固缩、嵴减少甚至消失,外膜破裂。自2012年提出铁死亡概念,近10年来对铁死亡的研究不断深入,发现其广泛参与心血管疾病、多种退行性疾病的发病过程,而通过有效方法调控铁死亡,将为该类疾病的防治提供新的途径。肌细胞内过量铁可引发过氧化损伤和线粒体密度下降、嵴断裂,破坏肌细胞结构和功能,引发肌少症。因此维持肌细胞铁的动态平衡,减轻铁死亡,是防治肌少症的重要方法。近年研究发现有氧运动可激活核因子E2相关因子2 (Nuclear factor E2-related factor 2,Nrf2)。Nrf2在适量ROS诱导下与E3泛素连接酶(kelch-like ECH-associated protein-1,Keap1)分离被激活,进入细胞核,与核内靶基因的抗氧化反应元件(antioxidant response element,ARE)结合,进而调节超过200多种抗氧化基因的表达,包括铁蛋白(Ferritin)、膜铁转运蛋白1 (ferroportin 1,FPN1)和铁调素(Hepcidin)及血红素加氧酶1(Hemoxygenase-1,HO-1)、谷胱甘肽(Glutathione,GSH)、GPx4、 SLC7A11等的表达。因此,近年Nrf2被认为是调控铁代谢和抑制铁死亡的关键基因。然而,运动是否可以通过Nrf2通路抑diABZI STING agonist试剂制线粒体铁死亡,改善老年肌少症尚未完全阐明。阐明Nrf2调控的铁死亡通路在有氧运动改善增龄肌少症中的作用机制。研究方法:12月龄SPF级C57BL/6雄性小鼠20只,随机分为老年对照组(old control,OC)和老年运动组(old exercise,OE),每组10只。小鼠进行16周中等强度的耐力运动。先进行1周适应性运动(速度为10～12 m/min,坡度为0°,运动时间为10 min/d),随后进行正式训练(1-2周速度为14 m/min;3-4周为15 m/min;5-10周为16 m/min;11-16周为17 m/min,每天运动60 min,坡度均为0°)。末次运动后24h,眼眶取血,分离血清。取左侧腓肠肌、股四头肌称取湿重。取右侧腓肠肌制备组织匀浆,差速离心法分离线粒体,采用浆蛋白和核蛋白提取试剂盒提取细胞核蛋白。取腓肠肌分别制作石蜡切片进行HE染色和超薄电镜切片。谷胱甘肽(Glutathione,GSH)、非血红素铁(non-heme iron)含量采用分光光度计法。血清铁蛋白(serum ferritin,SF),线粒体8-羟基脱氧鸟苷(8-hydroxy-2 deoxyguanosine,8-OHdG)和4-羟基壬烯酸(4-Hydroxynonena,4-HNE)测试采用ELISA法。Western blot检测腓COPD pathology肠肌铁代谢相关蛋白表达,包括细胞核Nrf2、GPx4、FTH1、膜铁转运蛋白1(ferroportin 1,FPN1),GAPDH为内参。研究结果:(1)与对照组老年小鼠(取材时为70周龄,大约相当于人的65～70岁)相比,老年运动组小鼠腓肠肌和股四头肌湿重、横截面积显著增加(腓肠肌:OC:146.99±6.45 mg,OE:183.25±5.63 mg,P<0.01;股四头肌:OC:224.31±15.39 mg,OE:261.56±27.96 mg,P<0.01)。电镜结果显示,老年运动组线粒体嵴排列整齐致密,肌丝明暗带排列整齐,Z线、M线清晰;老年对照组腓肠肌线粒体嵴断裂、呈空泡状或固缩,出现典型的铁死亡特征。结果表明在骨骼肌增龄性衰减中,有氧运动可显著减少肌线粒体铁死亡,维持骨骼肌形态与结构正常,改善肌少症。(2)与对照组相比,老年运动组机体铁储存(SF)和腓肠肌铁含量均下降(SF:OC:25.39±1.64 ng/ml,OE:19.91±1.42ng/ml,P<0.01;non-heme iron:OC:19.71±2.06μmol/gpro,OE:12.93±1.07μmol/gpro,P<0.01)。血清SF代表了机体的储铁量,降低的铁储存可以避免铁超载引发的神经系统损伤、糖脂代谢紊乱和过氧损伤等。已有研究表明游离的铁离子会和线粒体产生的ROS通过Fenton反应导致铁死亡。骨骼肌中较少的铁含量可能由三方面因素引起:(1)运动加速铁的利用,铁参与构成线粒体三羧酸循环中代谢酶的活性成分;(2)部分铁向肌细胞外释放,通过循环系统进行代谢;(3)部分游离铁以铁蛋白的形式储存避免其产生过氧化损伤。(3)老年运动组小鼠腓肠肌4-HNE和线粒体过氧化损伤标志物8-OHdG显著低于运动照组(4-HNE:OC:58.40±5.29ng/g,OE:37.15±4.67 ng/g,P<0.01;8-OHdG:OC:4.82±0.57 ng/mg,OE:2.16±0.31 ng/mg,P<0.01)。8-OHdG是线粒体DNA过氧化损伤的标志物,结果表明有氧运动减少了线粒体和骨骼肌细胞的过氧化损伤,这与机体降低的铁含量有关。(4)老年运动组小鼠腓肠肌GSH含量显著高于对照组(OC:157.45±44.24μmol/L,OE:364.42±98.53μmol/L,P<0.01),说明有氧运动促进GSH合成,GSH是GPx4发挥抗氧化功能的反应底物。(5)老年运动组小鼠腓肠肌细胞核Nrf 2表达量显著高于对照组(OC:0.16±0.01,OE:0.34±0.03,P<0.selleck产品01)。说明有氧运动组Nrf2与Keap1分离被激活,移位进入细胞核,促进其下游的基因表达。(6)老年运动组小鼠腓肠肌GPx4和FPN1、FTH1表达量显著高于对照组(GPx4:OC:0.42±0.03,OE:0.75±0.05,P<0.01;FPN1:OC:1.53±0.27,OE:2.28±0.44,P<0.01;FTH1:OC:1.02±0.11,OE:1.71±0.20,P<0.01)。FTH1增加可以促进游离铁储存,避免其发生Fenton反应导致铁死亡。FPN1则促进细胞内铁释放,GPx4表达量升高增强了肌细胞的抗氧化能力。近年发现Nrf2广泛参与机体血红素代谢的转录调控,FTH1、FPN1和GPx4均为Nrf2调控的下游靶基因,因此认为Nrf2是具有重要应用前景的抗铁死亡的干预靶点。未来在铁死亡相关疾病的研究中,运动激活Nrf2而改善铁代谢相关疾病进程将具有重要研究意义。研究结论:适度的有氧运动可以通过激活Nrf2通路,减少肌细胞的铁含量,缓解线粒体发生过氧化损伤,改善增龄引发的肌少症。