一、研究背景脊髓损伤(SCI)是指创伤性因素(如车祸伤、高处坠落、运动损伤)和非创伤因素(如肿瘤、感染、椎间盘退行性疾病)导致的脊髓暂时或永久性功能障碍,引发下肢瘫痪、持续性病理性疼痛、压疮和肺部感染等一系列并发症。世界卫生组织(WHO)评估每年有25-50万人患有SCI。SCI的病理特征是在最初机械性损伤后产生级联放大的炎症风暴,导致神经细胞死亡和持续的脱髓鞘反应,富含脂质的细胞膜和髓鞘碎片在损伤中心累积并在局部形成高脂微环境。伴随血脊髓屏障的破坏,大量外周免疫细胞浸润至损伤中Microbial mediated心。作为最主要的吞噬细胞,外周巨噬细胞可以吞噬和清除髓鞘碎片。在SCI后3天(开始浸润)至7天(达到高峰),巨噬细胞的主要生物过程从细胞迁移转向脂质分解,并在转录组水平表现出泡沫细胞的特征。尽管巨噬细胞最初的吞噬作用可以清除富含轴突抑制因子的髓鞘碎片,有利于再生微环境的重建,但持续的吞噬以及消化和排出受阻导致巨噬细胞中大量脂滴(LDs)的累积,促进“泡沫状”巨噬细胞的形成和炎症因子的释放,最终加重炎症微环境的紊乱。本人硕士期间的研究表明,敲除巨噬细胞清道夫受体1(MSR1)可以缓解巨噬细胞对髓鞘碎片的过度摄Liraglutide体外取,减少促炎性“泡沫状”巨噬细胞的形成和神经元凋亡,促进功能恢复。然而,单方面抑制巨噬细胞的吞噬作用虽可以减少胞质内LDs的累积,但大量未被清除的的凋亡细胞、轴突抑制性髓鞘碎片以及中性粒细胞也会持续存在,从而扩大局部炎症反应并阻碍轴突的再生与再髓鞘化。考虑到“泡沫状”巨噬细胞的形成是由于脂质的吞噬、消化与排出之间不平衡所导致,靶向促进LDs的消化与排出可能是减少SCI后“泡沫状”巨噬细胞负面影响的一个更好的切入点。自噬是一个保守的细胞内降解过程,通过双层膜结构的自噬体将蛋白质和细胞器包裹并递送至溶酶体降解来维持细胞的平衡。自噬也可以选择性降解特定的细胞器,被称为选择性自噬。2009年Singh等人首次在肝细胞中发现自噬可以选择性降解LDs,并将这一过程命名为“脂噬”。脂噬可以特异性识别泛素化标记的LDs并将其递送至溶酶体中降解,目前文献报道脂噬可以调节脂肪肝、神经退行性病变以及动脉粥样硬化中的脂质紊乱,并在疾病进展中扮演重要角色。但脂噬如何识别泛素化标记的LDs?其中泛素化系统如何调节脂噬的发生?以及脂噬在SCI后脂代谢紊乱中的作用均有待研究。二、研究目的(1)明确脊髓损伤后“泡沫状”巨噬细胞的形成过程以及时空分布;(2)探索脊髓损伤后巨噬细胞上自噬流紊乱是否参与LDs的累积;(3)寻找靶向LDs降解的关键脂噬受体,并验证其在脊髓损伤后“泡沫状”巨噬细胞LDs累积中的作用;(4)探索泛素化系统与脂噬的内在联系。三、研究方法第一章:通过免疫荧光(CD68,MBP)、油红染色、透射电镜从宏观和微观层面观察脊髓损伤后“泡沫状”巨噬细胞形成过程;利用巨噬细胞荧光霉素报告基因小鼠确定SCI后LDs累积的主要细胞来源;通过氯磷酸-脂质体清除小鼠巨噬细胞后观察SCI后LDs累积以及运动功能恢复情况。第二章:Western Blot和免疫荧光(LC3,SQSTM1)观察SCI后巨噬细胞自噬水平的变化;构建ATG7巨噬细胞条件性敲除小鼠,体内外实验观察ATG7条件性敲除对于脊髓损伤后LDs的累积以及运动功能恢复的影响。第三章:转录组测序以及小干扰RNA敲低实验筛选出可能的选择性脂噬受体;Western Blot和免疫荧光(OPTN,BODIPY)明确“泡沫状”巨噬细胞形成过程中OPTN表达量的变化以及细胞定位;构建OPTN巨噬细胞条件性敲除小鼠,体外实验观察OPTN敲除对于“泡沫状”巨噬细胞中LDs累积,炎症因子分泌以及神经元轴突生长状态的影响,体内实验观察OPTN条件性敲除对于脊髓损伤后LDs的累积以及运动功能恢复的影响。第四章:免疫共沉淀/质谱技术筛选出与OPTN可能结合的E3泛素连接酶;构建His-OPTN和Flag-Nedd4质粒并转染293T细胞,免疫共沉淀技术进一步明确OPTN和Nedd4的结合;构建CD68启动子AAV9过表达腺相关病毒,体内外实验观察Nedd4巨噬细胞过表达对于脊髓损伤后“泡沫状”巨噬细胞中LDs累积以及运动功能恢复的影响。四、研究结果本课题首先从宏观和微观角度阐明脊髓损伤后LDs的形成和累积过程,并通过巨噬细胞荧光霉素报告基因小鼠阐明LDs的累积主要发生在外周巨噬细胞中。进一步研究发现损伤区域“泡沫状”巨噬细胞自噬流紊乱,自噬的抑制可以显著促进巨噬细胞中LDs的累积并抑制运动功能的恢复,提出自噬在“泡沫状”巨噬细胞形成中的关键作用。通过转录组测序技术筛选出脂噬的关键受体OPTN,利用Cre-Loxp技术成功构建OPTN巨噬细胞特异性敲除小鼠模型,发现OPTN条件性敲除可以显著增加巨噬细胞中LDs的累积和炎症因子的释放,不利于再生微环境的重建。通过免疫共沉淀/质谱技术(IP/MS)筛选出调节OPTN的关键E3泛素连接酶Nedd4,并发现巨噬细胞中特异性过表达Nedd4可以促进OPTN对LDs的识别,进而启动LDs的脂噬降解,减少脊髓损伤后“泡沫状”巨噬细胞的形成,改善炎症微环境,减少神经元的死亡并促进轴突再生和下肢运动功能的恢复。五、结论脊髓损伤后外周巨噬细胞浸润至损伤中心并出现泡沫样表型,加重炎症损伤,不利于再生微环境重建。本研究发现脊髓损伤后巨噬细胞自噬通量受阻加重LDs的累RP56976研究购买积,筛选出靶向LDs的关键脂噬受体OPTN,并发现NEDD4可以促进OPTN对LDs的识别,从而激活脂噬,减少损伤区域“泡沫状”巨噬细胞中LDs的累积并促进功能恢复。本研究部分揭示了脊髓损伤后巨噬细胞LDs累积的分子机制,丰富了对损伤区域炎症微环境的理解,为脊髓损伤的治疗提供了新思路,具有一定的理论价值和潜在临床转化前景。