镉污染是当前严重危害动物与人类健康的环境问题。农业和工业活动中产生的镉经食物链进入机体蓄积而呈现毒害作用,肾脏是机体急性和慢性镉暴露主要的靶器官。前期研究已经证实溶酶体功能障碍引起的自噬抑制以及胱天蛋白酶依赖的细胞凋亡是镉致肾脏损伤的重要原因。哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)是一种丝氨酸/苏氨酸激酶,是细胞生长和增殖的重要调节因子。mTOR激酶存在于两种不同的多蛋白复合物:mTOR复合物1(mTORC1)和mTOR复合物2(mTORC2)。mTORC1对雷帕霉素非常敏感,其感受氨基酸、压力、能量等信号,通过影响合成代谢和分解代谢过程来调节细胞生长状态。相比之下,mTORC2对雷帕霉素不敏感,目前仅报道其响应生长因子并调节细胞存活以及细胞骨架。鉴于两种mTOR复合物在镉致小鼠肾脏损伤中的作用以及调控机制尚不清楚,本研究以Cdh16-Cre工具鼠和小鼠肾近端小管上皮细胞(KTPTS细胞)为模型进行体内外研究,探究mTORC1与mTORC2是否参与镉致小鼠肾脏损伤,并阐明两种mTOR复合物在镉致小鼠肾脏损伤中的调控机制,为防治镉污染物对动物和人类的危害提供重要理论支撑。主要研究内容如下:1.mTORC1/mTORC2在镉致小鼠肾脏损伤中的作用为探究镉对小鼠肾脏mTOR信号通路的影响,本研究使用镉(5 μM,12h)与mTOR激活剂 MHY1485(5μM,12h)、mTOR 抑制剂 Torin1(100nM,12h)设置对照试验;使用0、1.25、2.5、5 μM氯化镉处理小鼠肾近端小管上皮细胞建立体外细胞损伤模型,1.5mg/kg/d氯化镉腹腔注射5d建立体内肾脏损伤模型,通过蛋白免疫印迹、免疫荧光以及免疫组化检测镉对mTORC1与mTORC2活性的影响。结果显示,随着镉浓度的升高,p-mTOR(Ser2448)和p-mTOR(Ser2481)的蛋白表达水平逐渐升高(P<0.05或P<0.01);mTORC1 下游底物 p-4EBP1 与 mTORC2 下游底物 p-AKT(Thr308)、p-AKT(Ser473)蛋白表达水平极显著升高(P<selleckchem MS-2750.01)。为了检测mTOR在镉致小鼠肾脏损伤中的作用,使用核心组件Raptor与Rictor的小干扰RNA(体内)和RNAi腺相关病毒(体外)分别抑制mTORC1与mTORC2活性,通过CCK-8、RTCA、明场观察以及血清生化分析检测细胞毒性与肾脏损伤情况的变化。结果显示,抑制mTORC1与mTORC2均可以使镉暴露小鼠肾近端小管上皮细胞存活率进一步降低(P<0.01);小鼠肾近端小管上皮细胞与小鼠肾脏组织形态学损伤加剧;小鼠肾脏指数,肾损伤标志物Kim-1、NGAL,血清肾功能指标Scr、BUN含量显著或极显著升高(P<0.05或P<0.01)。结果表明体内外镉暴露激活小鼠肾脏组织mTORC1与mTORC2信号通路,抑制mTORC1与mTORC2均导致小鼠肾近端小管上皮细胞和小鼠肾脏组织对镉的毒性损伤更为敏感,二者的激活是镉暴露后肾脏细胞的存活机制。2.mTORC1/mTORC2在镉致小鼠肾脏自噬抑制中的作用为探究mTORC1与mTORC2在镉致小鼠肾脏自噬抑制中的作用,使用核心组件Raptor与Rictor的小干扰RNA(体内)和RNAi腺相关病毒(体外)分别抑制mTORC1与mTORC2活性,通过蛋白免疫印迹、质粒转染、免疫荧光检测小鼠肾近端小管上皮细胞与肾脏组织自噬水平的变化。结果显示,抑制mTORC1可以极显著降低镉暴露小鼠肾近端小管上皮细胞与小鼠肾脏组织LC3和p62蛋白表达水平(P<0.01),极显著减少自噬体数量(P<0.01),缓解镉引起的自噬流阻滞;抑制mTORC1可以极显著增加镉暴露小鼠肾近端小管上皮细胞TFEB核蛋白表达水平(P<0.01),进而恢复溶酶体膜蛋白(LAMP1、LAMP2),溶酶体水解酶(CTSB、CTSD、CTSL、GNS、SGSH、TPP1),液泡质子 ATP 酶(ATP6V1A、ATP6V1D、ATP6V1B1、ATP6V1B2)的表达,修复镉损伤的溶酶体功能。与抑制mTORC1结果一致,抑制mTORC2也可点击此处以在体内外缓解镉引起的自噬流阻滞。在mTORC1抑制模型的基础上,进一步抑制mTORC2检测小鼠肾近端小管上皮细胞自噬水平的变化,结果显示mTORC2可以独立于mTORC1介导镉致小鼠肾脏自噬抑制。抑制mTORC2可以极显著增加镉暴露小鼠肾近端小管上皮细胞与肾脏组织FOXO1核蛋白表达水平(P<0.01),进而极显著恢复溶酶体融合功能蛋白Rab7的表达(P<0.01),促进自噬体与溶酶体的融合。结果表明mTORC1可以通过TFEB介导镉暴露引起的溶酶体功能损伤,mTORC2可以通过FOXO1介导镉暴露引起的自噬体与溶酶体融合受阻,两种mTOR复合物的激活共同介导镉致小鼠肾脏细胞自噬抑制。3.mTORC1/mTORC2在镉致小鼠肾脏细胞凋亡中的作用为探究mTORC1与mTORC2在镉致小鼠肾脏细胞凋亡中的作用,使用核心组件Raptor与Rictor的小干扰RNA(体内)和RNAi腺相关病毒(体外)分别抑制mTORC1与mTORC2活性,通过蛋白免疫印迹、流式细胞术、免疫组化、TUNEL染色检测体内外肾脏细胞凋亡水平的变化。结果显示,抑制mTORC1与mTORC2均可以使镉暴露肾脏细胞凋亡关键蛋白Cleaved-PARP、Cleaved-Caspase 3蛋白表达水平进一步增加,Bax/Bcl2比值增加,细胞凋亡率升高,结果呈显著或极显著性(P<0.05或P<0.01)。进一步研究mTORC1与mTORC2参与镉致小鼠肾脏细胞凋亡的调控机制,结果显示抑制mTORC1与mTORC2均可显著抑制AKT的磷酸化活性;添加AKT的激活剂SC79(5 μM,12 h)与抑制剂MK2206(0.5 μM,12 h)检测AKT活性与细胞凋亡水平的关系,发现AKT的激活在镉致小鼠肾脏细胞凋亡中发挥抗Modeling human anti-HIV immune response凋亡作用。添加mTOR激活剂 MHY1485(5 μM,12 h)与 mTOR 抑制剂 Torin1(100 nM,12 h)探究 mTOR 调控下自噬与凋亡的关系,结果发现mTORC1与mTORC2是平衡镉暴露后肾脏自噬和凋亡水平的关键蛋白,二者的失调可以导致自噬与凋亡的异常转化。以上结果表明,①体内外镉暴露激活了小鼠肾脏mTORC1与mTORC2信号通路,二者的激活是镉暴露后小鼠肾脏细胞的存活机制;②mTORC1与mTORC2共同介导了镉致小鼠肾脏自噬抑制,mTORC1通过抑制转录因子TFEB介导溶酶体功能失调,mTORC2通过抑制转录因子FOXO1介导自噬体与溶酶体融合受阻;③mTORC1与mTORC2通过调控AKT活性共同拮抗镉致小鼠肾脏细胞凋亡,两种mTOR复合物是镉暴露小鼠肾脏细胞自噬和凋亡重要的平衡因子,通过限制自噬水平和拮抗细胞凋亡保护肾脏免受镉的毒性损伤。