肝脏是人体最重要的功能器官之一,具有胆汁分泌、促进消化、解毒、蛋白质氨基酸合成、糖原储存和脂肪代谢等功能。肝脏健康的内稳态和生理功能对于身体的正常运转至关重要。当肝脏出现如肝炎、肝硬化和肝癌等疾病而不能发挥正常功能时,机体就会逐渐枯竭和死亡,每年因肝脏病变导致的死亡人数高达上百万。因此,促进受损肝脏再生并使其迅速恢复正常功能至关重要。肝脏具有惊人的再生能力,这一特征已被广泛地应用于治疗肝脏疾病,如通过切除患者病变肝脏的受损部分或将部分健康肝脏移植到患者体内。但这些治疗方法仍存在很多问题,例如剩余肝细胞的恶性增殖导致肝癌和移植免疫排斥等。近年来,人们通过建立肝损伤模型,发现肝脏的再生能力从低等脊椎动物(如斑马鱼)到高等哺乳动物(如小鼠和人)都是保守的。这进一步推动了利用模式动物建立相应的疾病损伤模型,寻找肝脏修复再生的细胞来源和调控再生的分子机制,进而推动肝脏疾病靶向药物的研发筛选和干预治疗。斑马鱼肝脏具有与哺乳动物肝脏相似的解剖结构和细胞成分,近年来,研究发现在重度肝细胞损伤后肝细胞增殖能力缺失的情况下,胆管上皮细胞可以去分化为双潜能前体细胞,随后双潜能前体细胞再分化为成熟的肝细胞和胆管上皮细胞,从而帮助肝脏再生。研究人员利用斑马鱼模型揭示了BMP信号途径、m TORC1信号途径、Hippo信号途径和Notch信号途径等分子调控网络在胆管上皮细胞向肝实质细胞分化的过程发挥着重要作用,并且这些调控机制在进化上是保守的。虽然已确定了一些调控肝脏Recurrent ENT infections再生的分子信号,但肝脏再生是高度复杂和动态的过程,涉及胆管上皮细胞的去分化、前体细胞的再分化以及新生肝细胞的维持和稳定等,需要相应信号分子协同作用。但这些过程的具体调控机制仍未知。因此,建立高通量大规模的肝脏再生筛选平台,深入揭示调控肝脏再生的分子机制具有极大的临床和科研价值。在本研究中,我们利用斑马鱼个体小、胚胎透明、世代周期短和单次产胚量大等优势,开展了斑马鱼肝脏再生的大规模突变筛选,以寻找影响肝脏再生的突变体,进而探索其调控肝脏再生的机制。本研究以斑马鱼和小鼠为模式动物,旨在探究肝脏再生的分子调控机制。首先,我们利用团队早期构建的硝基还原酶/甲硝唑(NTR/Mtz)斑马鱼重D-Lin-MC3-DMA度肝脏损伤模型,进行了大规模化学诱变筛选。在肝脏重度肝脏损伤后的再生过程中,我们分离出一种十分有趣的突变体liver victor(lvv)~(cq137)。该突变体在24小时内的肝脏再生与野生型相似,但再生48小时,其肝脏体积明显减小,表明其致变基因对于肝脏正常再生至关重要,并且可能在新生肝细胞的维持和稳定中发挥关键作用。通过染色体定位克隆和测序分析,我们发现lvv突变体肝脏再生缺陷是由nibrin(nbn)基因无义突变所致,导致突变型Nbn蛋白无法像野生型Nbn蛋白一样定位于细胞核内。幸运的是,我们还分离到一个与nbn突变体非常相似的肝脏再生缺陷突变体,其突变基因鉴定为rad50。nbn和rad50都是MRN复合物的组成部分。同时,用Mre11的抑制剂mirin处理野生型斑马鱼也会导致相同的肝脏再生缺陷,表明nbn以完整的MRN复合物形式在肝脏再生中发挥作用。我们发现,在nbn突变体的肝脏再生过程中,从再生24小时到再生48小时,细胞凋亡TUNEL信号逐渐增强,而PCNA和Ed U增殖信号相对于野生型没有显著差异,这表明nbn突变体中肝脏再生缺陷是新生肝细胞凋亡所致。同时,我们检测到DNA损伤标志物γH2AX在突变体中表达上调,说明nbn突变体在肝脏再生过程中出现了内源性的DNA损伤积累。在细胞快速增殖过程中,DNA复制叉会减慢或停滞,这被称为DNA复制压力。复制压力引起的DNA损伤不利于基因组稳定性和细胞生存,这需要通过DNA损伤应答(DDR)机制来有效解决。该机制主要由三个PI3K样丝氨酸/苏氨酸激酶(PIKKs)控制,包括ATM、ATR以及DNA-PK。稳健的DNA损伤应答对于细胞周期检查点激活、DNA修复、衰老、凋亡和转录的诱导,以及基因组稳定性都是至关重要的。Mre11、Rad50和Nbn组成的MRN复合物是响应DNA双链断裂(DSBs)和复制压力的一个重要传感器,是DNA损伤应答的主要元件之一。MRN复合物及其组成成分对脊椎动物的正常发育至关重要,但该复合物在组织器官再生中的作用仍不清楚。为了进一步确认MRN复合物介导的DNA损伤应答确实在肝脏再生过程中被激活并发挥关键作用,我们检测了p-Chk1和p-Chk2的蛋白磷酸化水平。蛋白质印迹结果表明,p-Chk1在nbn突变体中明显低于野生型,而p-Chk2在野生型和突变体中无明显差异。随后,我们用Chk1抑制剂处理野生型胚胎,发现其肝脏再生表型与nbn突变体相似。此外,我们发现ATR抑制剂处理也会导致肝脏再生缺陷,而ATM抑制剂处理后肝脏再生相对正常。这表明在斑马鱼肝脏再生过程中,nbn以MRN复合物的形式通过ATR-Chk1信号途径维持和稳定新生肝细胞,促进肝脏的正常再生。通过整胚原位杂交实验,我们检测到nbn突变体中p53 m RNA的表达水平显著上调。通过引入p53~(m214k)突变体,我们发现P53蛋白功能缺失可以通过减少细胞凋亡来部分回救nbn突变体肝脏再生缺陷。此外,在斑马鱼纤维化肝脏模型中,nbn突变体表现出肝脏再生缺陷和肝细胞凋亡增加。类似地,在小鼠部分肝切除模型中,我们发现MRN复合物功能抑制会导致再生肝脏中肝细胞凋亡增加和肝脏功能损伤。这些结果表明,在其他形式的肝脏损伤中,MRN复合物也参与维持新生肝细胞的存活;MRN复合物在广泛的肝脏再生形式中发挥着关键作用,完善健全的DNA损伤应答机制对于肝脏再生至关重要。综上所述,nbn突变体的肝脏再生缺陷是由MRN复合物介导的DNA损伤应答这一信号途径功能障碍所致。本研究通过再生突变体的定位克隆、反向遗传敲除、过表达等方法,并利用抑制剂处理、原位杂交、抗体染色和蛋白质印迹等技术,对MRN复合物介导的ATR-Chk1信号相关DNA损伤应答在肝脏再生中的功能进行了深入研究,阐明了在严重肝损伤模型中肝脏再生后期新生肝细胞的稳定依赖于DDGefitinib-based PROTAC 3生产商R信号途径。本研究关于DNA损伤应答参与肝脏再生的探索,对其他组织或损伤模型的修复再生提供了新的参考价值,也为肝脏疾病相关研究提供了指导意义。