目的:骨肉瘤是一种常见的原发性恶性骨肿瘤,主要发生在儿童和青少年身上。由于它可能会通过微转移扩散,只进行根治性手术很难完全治愈。尽管20世纪70年代引入了联合化疗,使得总生存率从20%显著提高到了70%左右,但在过去几十年中,骨肉瘤的治愈率提高并不显著。目前各种调控分子靶点都被广泛研究,但是筛选出有效的骨肉瘤早期诊断、治疗、预后的可靠指标仍然是一个挑战。非编码RNA是细胞生命活动中重要的分子之一,其中miRNA通过调节细胞生长发育以及生物学功能,在包括骨肉瘤在内的多种疾病中发挥着重要的作用。miRNA-369被证明在肝癌、胃癌、甲状腺癌、前列腺癌、膀胱癌和肺癌等多种肿瘤中发挥重要作用,但是在骨肉瘤中的研究较少。使用RNA测序技术,可以筛查骨肉瘤组织与癌旁组织中的差异性表达的mRNA和miRNA,通过对差异显著的分子进行生物信息学分析,并进一步进行体内和体外功能研究,可以揭示它们在骨肉瘤发生和发展中的作用机制,为骨肉瘤患者提供新的治疗可能性,改善预后。NOTCH1在如胰腺癌、肺癌和宫颈癌中也被进行过多次研究,在骨肉瘤中也被发现能够促进骨肉瘤的生物学进程。但是miR-369是否能够通过NOTCH1影响骨肉瘤,miR-369和NOTCH1在骨肉瘤患者中的真实表达情况目前尚无过多研究。研究方法:1、搜集我院骨科就诊的60例骨肉瘤患者,术中取材骨肉瘤组织以及癌旁组织作为研究对象。选择3对骨肉瘤组织和癌旁组织进行RNA-seq,筛查差异性表达的miRNA和mRNA。本研究中所有60例患者都进行了二代高通量基因测序。2、通过R语言对差异性表达的miRNA和mRNA进行差异性表达分析,GO＿KEGG分析可能参与的生物学功能和信号通路。3、选择差异性表达显著的miRNA-369作为靶分子,通过生物信息学手段(miRDB,STARBASE3,TARGETSCAN软件预测)分析miRNA-369可能调节的mRNA,发现miRNA-369可能与NOTCH1具有靶向结合作用,而NOTCH1在mRNA筛查中存在显著差异。4、使用实时荧光定量PCR技术和免疫组化技术,验证miRNA-369和NOTCH1基因在收集的60例骨肉瘤组织和相邻的非肿瘤组织中的表达水平差异,并分析二者之间的相关性。研究还会分析这两个基因的表达情况与患者的临床病理特征之间的关系。5、培养三种不同分化程度的骨肉瘤细胞U2OS、MG63、SW133和HFOB1.19细胞系,荧光定量PCR分析miRNA-369和NOTCH1的表达水平。骨肉瘤细胞U2OS和MG63细胞中分别转染miRNA-369和miRNA-369 inhibitor上调、下调miRNA-369,一系列实验来评估miRNA-369对于骨肉瘤细胞的影响。通过实时荧光定量PCR和蛋白质免疫印迹技术,证实miRNA-369能够调节NOTCH1的表达。在U2OS细胞中通过免疫荧光染色进一步检测miRNA-369对于NOTCH1的调节作用。使用CCK8实验评估miRNA-369对细胞增殖的影响,以及Transwell实验来分析miRNA-369对细胞迁移的影响。最后,通过体外实验评估miRNA-369对骨肉瘤细胞生物学行为的影响。6、STAR获悉更多BASE3软件预测miRNA-369与NOTCH1的3’UTR区域的结合序列,构建结合序列的野生型和突变型荧光素酶报告基因载体,分析miRNA-369对NOTCH1的结合与调Viral infection控。7、为了印证miRNA-369是否通过NOTCH1影响骨肉瘤细胞U2OS和MG63的生物学功能,我们对过表达miRNA-369的骨肉瘤细胞,转染NOTCH1逆转的表达,CCK8实验和Transwell实验旨在研究miRNA-369是否通过调控NOTCH1进而影响骨肉瘤细胞的增殖和迁移水平。8、BALB/c裸鼠分为三组,分别注射转染了无意义小链+vector组,无意义小链+NOTCH1组和miRNA-369+NOTCH1组的骨肉瘤细胞构建骨肉瘤模型。通过HE染色来检测骨肉瘤的形成情况。此外,研究人员还使用了蛋白免疫印迹、实时荧光定量PCR和免疫组化来评估骨肉瘤组织中NOTCH1的表达情况,以及肺部转移情况,体内水平分析miRNA-369是否通过NOTCH1影响骨肉瘤的生物学进程。结果:1、设定阈值为|log2(FC)|>1&p.adj<0.05,满足这一阈值的差异表达mRNA有45个,其中高表达22个,低表达23个,NOTCH1表达上调5.16倍。对表达差异更为明显(log2Fold Change大于∣2∣)的17个mRNA进行GO＿KEGG分析,发现他们可能参与核输入信号受体活性、丝裂原活化蛋白激酶结合、蛋白激酶B结合等多种生物学过程。2、设定阈值设为|log2(FC)|>1&p.adj<0.05,满足这一阈值的差异表达miRNA有10个,其中高表达6个,低表达4个,miRNA-369表达下调4.53倍。根据KEGG分析结果,这些miRNA可能在多种生物过程中发挥作用,包括Notch信号通路、脂肪酸生物合成、甲状腺激素信号通路、鞘糖脂生物合成、吗啡成瘾、Ras信号通路、癌症中的蛋白多糖、肾细胞癌、胆碱能突触、轴突引导、胰腺癌、鞘磷脂信号通路、调节干细胞多能性的信号通路、非小细胞肺癌、TGF-β信号通路、FAK通路等。这些miRNA可能通过参与这些信号通路的调节,影响细胞的生长、分化、转移等生物学行为,并在多种疾病的发生发展中发挥作用。3、选择miRNA-369作为靶分子,MIRDB、STARBASE3、TARGETSCAN数据库检索筛选到3确认细节04个可能结合和调节的蛋白,其中NOTCH1于我们mRNA筛选中表达上调。并且NOTCH1在骨肉瘤患者NGS测序结果中存在突变比例较高,部分患者存在NOTCH1表达激活,NOTCH1突变与患者不良预后存在一定相关性。4、miRNA-369和NOTCH1在骨肉瘤的发生和发展中可能起到一定的作用。实时荧光定量PCR检测表明,在60例骨肉瘤组织与癌旁组织相比,miRNA-369在肿瘤组织中表达显著比癌旁组织低(P<0.01),NOTCH1在骨肉瘤标本中的表达显著比瘤旁组织高(P<0.05),二者呈负相关(Y=-0.6148*X+1.587,R2=0.6921,P<0.05)。免疫组化检测的结果也支持NOTCH1在骨肉瘤中的高表达。NOTCH1的高表达与miRNA-369的低表达与患者的不良预后具有相关性,并且在肿瘤患者的血液标本中NOTCH1高表达,miRNA-369低表达。5、三种不同分化程度的骨肉瘤细胞系中,较低分化的U2OS细胞miRNA-369表达最低,NOTCH1表达最高。过表达miRNA-369的U2OS和MG63细胞系,实时荧光定量PCR蛋白质免疫印迹实验提示NOTCH1的表达低于无意义小链对照;反之,转染miRNA-369 inhibitor的骨肉瘤细胞,NOTCH1的表达高于无意义小链对照。U2OS细胞免疫荧光检测提示miRNA-369降低了NOTCH1的胞内表达荧光信号。6、STARBASE3软件预测miRNA-369与NOTCH1的3’UTR区UCAGCAGUAUUAU序列结合,转染NOTCH1结合序列的野生型和突变型荧光素酶报告基因表达载体后,HFOB1.19细胞的表达情况发生了变化,荧光素酶活性分析提示miRNA-369显著抑制野生型而非突变型NOTCH1的表达,提示miRNA-369与其3’UTR区的序列结合。7、与无意义小链对照相比,转染miRNA-369的骨肉瘤U2OS和MG63细胞增殖和迁移被抑制;反之,转染miRNA-369 inhibitor的骨肉瘤细胞促进了细胞的增殖和迁移能力。8、共转染miRNA-369和NOTCH1的U2OS和MG63细胞系,恢复了miRNA-369对NOTCH1表达的负调控作用,CCK8实验和Transwell实验的结果也表明,抑制miRNA-369可以促进骨肉瘤细胞的增殖和迁移。这些结果进一步证实了miRNA-369和NOTCH1之间的相互作用,以及它们在骨肉瘤细胞的生物学行为中的重要性。9、骨肉瘤模型中,vector+miRNA-369组骨肉瘤细胞浸润弱于vector+NC组,miRNA-369+NOTCH1组恢复骨肉瘤的进程;相应的,骨肉瘤组织及肺转移组织的荧光定量PCR、蛋白免疫印迹、免疫组化检测结果均提示vector+miRNA-369组NOTCH1表达下调,miRNA-369+NOTCH1组NOTCH1表达恢复,这些体内实验证明miRNA-369可以通过影响NOTCH1影响骨肉瘤的增殖迁移。结论:1、多种RNA在骨肉瘤组织和瘤旁组织中存在差异性表达的现象,其中在骨肉瘤和瘤旁组织比较时mRNAs和miRNAs都可能存在差异表达的现象。通过对差异表达的mRNA分析发现,差异分子主要集中于Notch信号通路、癌症进程相关通路、干细胞调节等通路,其中miRNA-369于骨肉瘤组织表达下调,NOTCH1表达上调。2、miRNA-369被证明可以与NOTCH1在3’UTR区域具有结合作用,并且能够负向调节NOTCH1。3、miRNA-369对于骨肉瘤细胞的增殖和迁移水平具有一定的抑制作用。4、体内和体外的水平均证明miRNA-369能够通过能够NOTCH1调节骨肉瘤细胞的增殖和迁移,影响骨肉瘤的增殖迁移。