目的:脑出血(intracerebral hemorrhage,ICH)是一种有着高死亡率和发病率特点的疾病。已有文献报道,微小RNA(micro RNA,miRNA)介导了脑出血的发病机制。我们通过使用miRNA微阵列计数对脑出血和正常组样本进行测序发现miR-466d-3p在脑出血后差异性低表达。已有大量体内,体外实验证明程序性坏死在脑出血后的组织损伤中发挥重要作用。因此本课题旨在探究miR-466与小鼠脑出血神经细胞损伤后程序性坏死的关系,并为ICH治疗寻求新的靶点。方法:1.体内实验:采用右基底节immunostimulant OK-432区注射胶原酶IV建立C57BL/6小鼠脑出血模型。按照模型建成后第12h、24h、48h的时间节点,通过WTaurineestern blot检测小鼠ICH后脑组织中磷酸化的混合谱系激酶结构域样(phospho-mixed lineage kinase domain-like,p-MLKL)蛋白、RIPK3(receptor-interacting protein kinase3,RIPK3)随时间变化的蛋白表达曲线。2.脑出血体外模型是利用小鼠海马神经元细胞系(HT22)加入hemin诱导。TRIzol法提取血肿周围组织RNA及HT22细胞造模后RNA,使用实时荧光定量PCR(real-time fluorescence quantitative PCR,rt-q RCR)检测脑出血模型miR-466的表达情况。3.通过脑室内注射给药miR-466激动剂(miR-466 agomir)以过表达miR-466,3天后构建小鼠脑出血模型。脑出血模型后24h我们评估了脑水肿和神经功能缺损;小鼠脑出血模型后第25天开始通过水迷宫实验评估小鼠的空间记忆学习能力。在HT-22建立离体脑出血模型前转染miR-466模拟物(miR-466 mimics)以过表达miR-466;再通过Western blot检测表达miR-466对RIPK3、p-MLKL蛋白表达变化的影响。4.分别对小鼠脑组织冰冻切片及HT-22细胞进行RNA荧光原位杂交(FISH)及免疫荧光双染,观察miR-466、RIPK3的表达、定位。采用双荧光素酶报告基因实验验证miR-466与RIPK3的靶向关系。结果:通过rt-qPCR结果分析发现,与sham组相比,ICH小鼠脑组织中及HT22离体脑出血模型后miR-466的水平是下调的。Western blot结果表明,小鼠ICH后脑组织中RIPK3、p-MLKL表达相比于假手术(sham)组明显升高,并且在脑出血24h最明显。侧脑室注射miR-466 agomir后显著降低了RIPK3、p-MLKL蛋白表达水平,同时减轻了小鼠ICH导致的脑水肿、神经功能Ceralasertib molecular weight缺陷,改善了空间学习记忆能力。同时体外实验显示转染miR-466 mimics后也显著降低了RIPK3、p-MLKL蛋白表达水平。FISH实验显示ICH后miR-466荧光强度较sham组下降,定位于胞质,结合免疫荧光的双染,显示ICH后RIPK3荧光明显增强,并且在ICH小鼠血肿周围脑组织中发现miR-466和RIPK3共定位于胞质,部分RIPK3移入核内,而过表达miR-466的ICH组,这种共定位及RIPK3的移位未被发现。双荧光素酶报告基因实验验证了miR-466和RIPK3的3’UTR之间的靶标关系。结论:我们的研究发现ICH后发现RIPK3依赖的程序性坏死。miR-466通过靶向RIPK3调控小鼠ICH程序性坏死。