研究背景:红细胞(Red Blood Cells,RBCs)输注是改善多种原因所致贫血的主要治疗方式,具有重要的临床应用价值,但由于资源有限、保存周期较短、输血相关疾病传播风险等限制,目前国内外的红细胞供应均十分紧张,且存在多种输注风险,而利用干细胞制备红细胞用于临床有望成为未来血液供应和保障的新模式。作为红细胞体外制备的起始种子细胞,人胚胎干细胞(human Embryonic Stem Cells,h ESCs)相对于成体的造血干细胞具有更强大的自我更新能力和三胚层分化潜能,能够大规模扩增,是获得大量红细胞的理想种子细胞。然而体外诱导h ESCs生成的培养红细胞(cultured Red Blood Cells,c RBCs)目前还难以成为临床级使用的血液制品,其最大的障碍莫过于c RBCs的体积大,脱核率低,表达胎儿型血红蛋白(Fetal Hemoglobin,Hb F)。大量研究表明除外周血(Peripheral Blood,PB)来源c RBCs外,多能干细胞来源c RBCs均缺乏成人型血红蛋白(Adult Hemoglobin,Hb A)的表达。因此,为了探究不同来源c RBCs的这些差异和功能不成熟的原因,更好地用于多能干细胞体外制备红细胞,课题组将不同来源c RBCs进行了甲基化芯片分析,从基因水平分析c RBCs功能不完善的原因。通过分析发现在h ESCs来源c RBCs(h ESCs-c RBCs)中发生超甲基化同时又在PB来源c RBCs(PB-c RBCs)中发生低甲基化的位点(Ery-DMS-h ESCs~+/PB~-)同时出现差异性P值最小、且富集度最高的分子——白三烯B4(Leukotriene B4,LTB4)受体:包括LTB4R和LTB4R2。LTB4R和LTBR2是LTB4下游的受体,而LTB4是由花生四烯酸经过多个步骤产生的,该途径还同时产生了LTC4等其他白三烯亚型。而花生四烯酸的另外两条代谢通路,细胞色素P_(450)、环氧合酶(COX)途径的代谢产物羟基二十碳四烯酸(HETEs)和前列腺素E_2(PGE_2)已经被多篇文献报道,表明其可以促进造血干/祖细胞(Hematopoietic stem and progenitor cells,HSPCs)的生成及红细胞的发育。研究表明LTB4可以促进人脐带血(Umbilical Cord Blood,UCB)来源CD34~+HSPCs增殖和向粒系分化,并且具有抗凋亡的作用。而LTB4和LTC4、LTD4等其他白三烯亚型也可以促进小鼠和斑马鱼的造血细胞生成。在白三烯对其他的调控研究中发现,LTB4可以促进小鼠胚胎干细胞诱导体系中血管的生成。而根据课题组比对不同来源c RBCs的LTB4受体差异甲基化和表达,发现LTB4R和LTB4R2在h ESCs-c RBCs中高甲基化,低表达,在PB-c RBCs中低甲基化,高表达。因此,我们推测在体外诱导培养体系中通过添加LTB4可能改变这种差异,从而促进h ESCs-c RBCs的发育和成熟。研究目的:基于上述的分析和问题的提出,本研究旨在深入探究LTB4是否促进h ESCs向红细胞的分化及成熟,以及其作用的机制,从而优化红系细胞诱导方案,促进h ESCs-c RBCs的发育成熟和功能发挥。研究方法:为确定LTB4在h ESCs向红细胞发育和成熟调控中的关键作用,首先通过调整细胞接种密度,提高h ESCs-c RBCs诱导体系的扩增效率,并通过实时定量PCR(Real-time quantitative polymerase chain reaction,RT-q PCR)实验观察LTB4受体在h ESCs-c RBCs诱导体系中的表达变化。其次在诱导体系不同阶段中添加LTB4或LTB4代谢通路抑制剂,判断LTB4对红系分化成熟的影响及作用细胞谱系;细胞经流式细胞术(Flow Cytometry,FCM)、表型分析、造血集落形成实验、RT-q PCR、瑞氏-姬姆萨染色完成成熟程度的比较。接着通过细胞转录组测序(RNA-sequencing,RNA-Seq)分析、生物信息学预测判断LTB4作用于其受体后影响的下游信号通路,通过筛选差异表达基因,对筛选出的差异表达基因进行GO(Gene Ontology),KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)及PPI(Protein-Protein Interaction Networks)分析,明确LTB4作用机制。最后在UCB来源单个核细胞(UCB-Mononuclear Cell,UCB-MNCs)向红细胞诱导的体系中添加LTB4,验证LTB4对红系分化成熟的影响;通过调整LTB4的作用阶段分析LTB4在UCB来源c RBCs(UCB-c RBCs)发挥作用的细胞谱系;细胞经FCM、表型分析、RT-q PCR、瑞氏-姬姆萨染色完成成熟程度的比较。研究结果:在本研究中,我们首先对h ESCs进行培养及扩增,采用无饲养层的诱导体系,且该细胞高水平表达SSEA4和TRA-1-60等多能性干细胞的标志基因及蛋白;表明体外培养的h ESCs具有良好的多能性并稳定传代。我们采用了两种密度(2×10~5/孔和6×10~5/孔)接种细胞,利用三维拟胚体(Embryoid Bodys,EBs)培养方案,成功建立并优化了分阶段诱导h ESCs向红细胞分化的诱导体系。倒置相差显微镜观察本研究所用三维诱导体系中h ESCs形成EBs逐渐变大并形成空泡,随后逐渐释出大量折光性强的单个悬浮细胞;流式细胞术检测低密度实验组CD43~-CD45~-CD34~+CD144~+生血内皮细胞(Hemogenic Endothelia Cells,HECs)比例高于高密度实验组,并且于诱导分化体系Day 6达到高峰21%后逐渐下降,低密度实验组CD34~+CD45~+HSPCs和CD34~-CD45~+更成熟的HSPCs(Mature HSPCs,m-HSPCs)比例高于高密度实验组,并且于诱导分化体系Day 12达到高峰23%后逐渐下降,早期低密度实验组CD71~+CD235a~+红细胞比例高于高密度实验组,最终均增加至90%以上;线粒体膜电位检测和造血集落形成实验显示低密度实验组生成的造血细胞具有良好的代谢状态和多向分化潜能,对集落生长有明显的促进作用,特别是代表早期红细胞的BFU-E比例增加显著;血红蛋白含量分析结果显示,低密度实验组Day 12的血红蛋白含量较高密度实验组高,最终Day 18获得的c RBCs血红蛋白含量无明显差异,但低密度实验组c RBCs的扩增倍数有明显提升。在此基础上利用RT-q PCR检测低密度实验组LTB4受体表达情况,结果显示随着诱导时间的延长,LTB4受体相对表达量逐渐增加,并在造血细胞中高表达,提示LTB4及其受体可能在红细胞发育过程中发挥作用。我们通过分阶段添加50 n M的LTB4因子或50μM的抑制剂Zileuton(一种5-脂氧合酶抑制剂,阻碍了完整的LTB4代谢途径),探究其对h ESCs向中胚层细胞、HECs、HSPCselleck LGX818s及c RBCs分化的影响。整个诱导过程分为四阶段,包括第一阶段中胚层分化,第二阶段定向生血内皮细胞分化,第三阶段定向红系分化,以及第四阶段红细胞成熟。流式细胞术检测LTB4实验组Day 6表达CD43~-CD45~-CD34~+CD144~+HECs均高于对照组,第二阶段添加抑制剂组低于对照组;LTB4实验组Day 12表达CD34~+CGSK2118436研究购买D45~+HSPCs和CD34~-CD45~+m-HSPCs比例均高于对照组,抑制剂组表达CD34~-CD45~+m-HSPCs均低于对照组,实验组与对照组CD71~+CD235a~+红细胞比例逐渐增加至90%以上,同时第一和第二阶段添加LTB4实验组Day 6细胞红系造血集落比例高于对照组,其中第二阶段添加LTB4实验组造血集落数量显著高于对照组;实验组与对照组诱导获得c RBCs活性均在90%以上,第一、第二和第四阶段添加LTB4实验组诱导获得c RBCs扩增倍数高于对照组,第二阶段添加抑制剂组诱导获得红细胞数量少于对照组,其中第二和第四阶段添加LTB4实验组的c RBCs中β珠蛋白相对表达量均高于对照组,第二和第四阶段添加抑制剂组均低于对照组,同时第二和第四阶段添加LTB4实验组的c RBCs脱核率高于对照组,提示LTB4在h ESCs向红细胞分化过程中起正向调节作用。在初步明确LTB4信号调控h ESCs向红细胞分化的基础上,为了探索其调控造血分化的分子机制,我们进一步通过MGIseq2000测序平台及DNBseq G400测序平台对添加LTB4因子Day 6处于造血分化早期的细胞进行RNA-Seq,并结合测序数据对差异表达基因进行比对分析。结果显示,在第一阶段添加LTB4组与对照组细胞相比,差异基因数量共有1012个;在第二阶段添加LTB4组与对照组细胞相比,差异基因数量共有991个。差异基因KEGG富集分析结果显示,第一阶段添加LTB4组与对照组细胞的差异基因主要富集在钙、MAPK、PI3K-Akt、Rap1、Ras、Wnt等造血相关调控信号;第二阶段添加LTB4组与对照组细胞的差异基因主要富集在AA代谢、NF-κB、肾素-血管紧张素系统、甲状腺激素的合成等造血相关调控信号,为我们初步研究LTB4对造血分化作用的机制提供了重要的依据。在上述的研究中我们意外的发现LTB4促进h ESCs-c RBCs脱核,为了验证该现象,我们在UCB-c RBCs的诱导体系中分阶段添加了50 n M的LTB4因子。结果显示,LTB4可以促进UCB来源HSPCs和c RBCs扩增,且UCB-c RBCs的脱核率显著增加,但对UCB来源HSPCs和c RBCs的表达比例和UCB-c RBCs的β珠蛋白表达无明显影响。以上研究结果证实LTB4确实可以促进c RBCs脱核。研究结论:综上所述,本研究成功利用不同细胞接种密度优化了三维EBs培养下h ESCs向红细胞定向诱导分化体系,在诱导分化的Day 18成功获得了高表达CD235a的c Roxalic acid biogenesisBCs。初步考察了LTB4与代谢通路抑制剂在h ESCs向红细胞分化中的作用,发现外源性LTB4促进h ESCs向中胚层细胞、HECs、HSPCs和c RBCs的分化,在不同阶段外源性LTB4对h ESCs-c RBCs分化总体表现为正向调节,并在UCB-c RBCs的诱导体系中验证其脱核作用。外源性LTB4的作用机制可能与Rap1、PI3K-Akt、Wnt等信号通路有关,而第二阶段其作用机制可能与花生四烯酸代谢、NF-κB、甲状腺激素合成等信号通路有关。本研究为深入探讨LTB4信号在h ESCs向红细胞发育成熟中的作用机制,构建优化的h ESCs向红细胞分化成熟的定向诱导体系,以及进一步高效制备h ESCs-c RBCs提供理论依据和技术支撑。