研究目的观察氡暴露致人支气管上皮细胞恶性转化过程中能量代谢变化的特点,并初步探讨lncRNAPVT1通过miR-143-3P/HK2调节Warburg效应在长期氡暴露致BEAS-2B细胞恶性转化过程中的作用机制。研究方法1.建立氡暴露致人支气管上皮细胞(human bronchial epithelial cells,BEAS-2B)恶性转化模型。氡暴露的浓度为20000 Bq/m3,暴露时间为20 min/次,每次氡暴露结束后细胞在Transwell培养皿内培养3-4天后传出,并开始下一轮氡暴露。按上述氡暴露方法重复25次。同时设立未暴露氡的传代对照组BEAS-2B细胞,每隔5代检测细胞的软琼脂克隆形成能力、增殖活性、细胞侵袭性和迁移能力。2.氡暴露致BEAS-2CB-839临床试验B细胞恶性转化不同阶段(15、20、25代)能量代谢变化和糖酵解限速酶的改变。采用生化法检测葡萄糖消耗量、乳酸含量、乳酸脱氢酶活性。Western blot 检测乳酸脱氢酶 A(lactate dehydrogenase A,LDHA)、葡萄糖转运蛋白 1(glucose transporter 1,GLUT 1)、已糖激酶 2(hexokinase 2,HK2)、M2型丙酮酸激酶(pyruvate kinase M2,PKM2)蛋白表达水平。3.通过starBase等软件预测筛选和lncRNA PVT1具有结合位点的候选miRNA。通过qRT-PCR检测在氡暴露致BEAS-2B细胞恶性转化不同阶段中lncRNAPVT1 与 miR-143-3p 的表达情况。通过 qRT-PCR 检测 lncRNAPVT1 对miR-143-3p调控影响;利用双荧光素酶报告基因实验验证lncRNA PVT1与miR-143-3p 靶向结合的可能性。4.通过转染si-PVT1,观察氡暴露25代细胞(Rn-25)PVT1抑制后miR-143-3p和HK2基因表达情况。细胞共转染si-PVT1和miR-143-3p inhibitor至Rn-25细胞,观察lncRNA PVTl/miR-143-3P/HK2信号通路对长期氡暴露后致BEAS-2B细胞恶性转化后Warburg效应的影响,并观察该通路对细胞恶性表型的影响(增殖活性、细胞侵袭性和迁移能力)研究结果1.BEAS-2B细胞经长期氡暴露后发现:随着染毒代数的增加BEAS-2B细胞生长速率逐渐加快、从第20代(Rn-20)开始BEAS-2B细胞的侵袭迁移能力明显增强,氡暴露后第20、25代细胞软琼脂克隆数明显高于传代对照组。2.长期氡暴露致BEAS-2B细胞恶性转化不同阶段能量代谢的变化发现:与传代对照组比较,Rn-20代葡萄糖消耗量、乳酸含量和LDH含量均明显增加,氡暴露初期BEAS-2B细胞LDHA、GLUT1、HK2和PKM2蛋白表达无明显变化,由第20代出现恶性转化表型时开始蛋白表达明显上升。提示氡暴露后BEAS-2B细胞能量代谢的方VP-16式由氧化磷酸化转变为有氧糖酵解。3.lncRNAPVT1通过miR-143-3P/HK2调控有氧糖酵解在BEAS-2B细胞恶性转化过程中的作用:随着氡暴露时间延长,lncRNAPVT1表达明显上升,并通过lncRNAPVT1/miR-143-3p/HK2调控细胞能量代谢,继而影响细胞的恶性表型。与传代对照组比较,lncRNAPVT1和HK2从第20代开始表达ImmunoCAP inhibition量明显上升,miR-143-3p表达量明显下降。转染si-PVT1后Rn-25细胞有氧糖酵解受抑制,细胞恶性表型下降。miR-143-3p mimics与PVT1-MUT共转染组荧光素酶活性较其他组并无明显降低。4.转染si-PVT1后Rn-25细胞miR-143-3p上升,HK2的表达表达量明显下降。si-PVT1和miR-143-3p inhibitor共转染组细胞增殖能力、克隆形成能力及迁移能力较单独转染si-PVT1组细胞均明显增强。研究结论1.长期氡暴露诱导BEAS-2B-Rn细胞恶性转化中细胞能量供给由氧化磷酸化转为有氧糖酵解为主。2.长期氡暴露诱导lncRNAPVT1高表达,通过抑制miR-143-3p促进HK2的表达,使细胞能量代谢呈现Warburg效应,继而促进BEAS-2B细胞出现恶性转化。