D-阿洛糖是稀有糖的一种,虽然与蔗糖相比D-阿洛糖的甜度为80%,但其热量极低且systems genetics无毒,具有许多有益的生理功能,包括抗肿瘤、抗癌、抗炎、抗骨质疏松、抗高血压、低温保护、神经保护和免疫抑制等功能,被广泛地应用于食品、农药、临床治疗和医疗保健品中。目前合成稀有糖的方法包括化学合成法和生物合成法,通过微生物酶法制备D-阿洛糖具有合成简单、选择性高且副产物低等特点。L-鼠李糖异构酶最先用于L-鼠李糖和L-鼠李酮糖之间的酮糖异构化反应,具有广泛的底物特异性,是最早发现可以异构化D-阿洛酮糖生成D-阿洛糖的酶,其转化率高于其他酶,本论文针对L-鼠李糖异构酶催化D-阿洛酮糖生成D-阿洛糖开展一系列研究工作:(1)本论文通过筛选不同来源的L-鼠李糖异构酶,分别在大肠杆菌BL21(DE3)和BL21 star(DE3)感受态细胞中构建重组质粒,筛选出最优的表达宿主BL21 star(DE3)。以D-阿洛酮糖作为反应底物,分别测定30℃、55℃和70℃下不同来源的L-鼠李糖异构酶异构化D-阿洛酮糖生产D-阿洛糖的转化率,发现枯草芽孢杆菌的L-鼠李糖异构酶对底物的催化效率更高,然后根据大肠杆菌的偏好性进行密码子优化,在70℃下经过基因优化后的L-鼠李糖异构酶催化D-阿洛酮糖产D-阿洛糖的转化率可以达到27.13%,并研究了L-鼠李糖异构酶的各种酶学性质,测得枯草芽孢杆菌来源的L-鼠李糖异构酶的最适温度是70℃,最适p H是9.0,根据Lineweaver-Burk双倒数作图法算得米氏常数K_m值为3.45 mol/L。(2)以枯草芽孢杆菌来源的L-鼠李糖异构酶作为研究对象,对酶的二级结构进行初步分析,将蛋白质结构与配体D-阿洛酮糖和D-阿洛糖进Y-27632采购行分子对接,采用丙氨酸扫描、饱和突变和合理设计等方法分析蛋白质和配体的相互作用,构建了两个突变体库,对突变体产D-阿洛糖的产率进行分析,发现在55℃下,突变体W184H对D-阿洛糖的转化率MLN4924临床试验提高了10.37%、D325S提高了15.3%,D325M提高了55.73%。通过SWISS-MODEL三维建模分析发现金属离子Mn~(2+)可能对突变体D325S和D325M催化D-阿洛酮糖生成D-阿洛糖的影响不大,同时通过分子动力学模拟分析了突变体W184H,D325M和D325S在与底物D-阿洛酮糖的结合时的RMSD值、RMSF值和分子结合自由能,并与原始酶相比较,分析结果均表明突变体的蛋白质构象更加稳定,更有利于催化D-阿洛酮糖向D-阿洛糖转化,为D-阿洛糖的生产奠定了基础。(3)通过对突变体W184H,D325M和D325S蛋白酶的理化性质的研究,发现突变酶的最适反应温度降低到60℃,最适p H仍保持在9.0,同时酶的稳定性较原始酶更好。为了更好地提高酶的活性,将L-鼠李糖异构酶进行双点突变,成功构建了双突变体K227E-W184H、K227E-D325S和K227E-D325M,研究了双突变体制备D-阿洛糖的方法。本论文首次通过生物信息学的方法对枯草芽孢杆菌来源的L-鼠李糖异构酶的蛋白质结构进行同源建模、分子对接等分析,初步分析L-鼠李糖异构酶的催化活性位点,根据其结构特点进行关键氨基酸突变,得到转化率提高的突变体,对分析其催化机理具有指导作用,对进一步将L-鼠李糖异构酶应用于D-阿洛糖制备具有重要的意义。