MicroRNA(miRNAs)是目前研究较多的表观遗传调控机制之一,是一种小的(20-40 nt)非编码RNA分子,具有高度保守性、时序性和组织特异性。MiRNAs可以与靶基因的3′-UTR区互补序列结合,降解mRNA或抑制蛋白质翻译过程,进而广泛参与细胞内的基本生物学过程。因此,miRNAs在生物个体的生长发育、机体疾病的发生进展领域中备受关注。与蛋白质编码基因类似,一方面,miRNAs可以通过DNA甲基化和/或特定的组蛋白修饰等发生表观遗传调控;另一方面,miRNAs可以与基因转录产物mRNA的3′-UTR区互补序列结合,通过抑制驱动翻译的关键酶,或基因表达相关的特定蛋白质复合物,从而影响细胞内基因的正常转录和翻译过程。MiR-371-373基因簇位于染色体19q13.4上,可被转录加工成pre-miR-371-373,形成包括miR-371在内的四种成熟mRNA包括miR-371-3和miR-373*。已经发现,miR-372在多种恶性肿瘤中表达异常,根据靶向的基因不同,miR-372作为抑癌因子或致癌因子发挥作用。但是,有关miR-372与染色质重塑酶间的互作尚无报道。INO80染色质重塑酶(INO80复合物)是由15个亚基组成的复合物,在ATP能量驱动下可以催化核小体沿着DNA滑动、或将一些组蛋白变体如H2A.Z从染色质中置换出来。INO80复合物中的八个核心亚基包括Arp5、Arp8、TIP49a/b、Ies2、Ies6、Arp4和YY1,从酵母到哺乳动物细胞高度保守,组成HSA和SNF2两个功能模块,对维持INO80复合物的全酶活性起着至关重要的作用。因此,INO80催化亚基或核心亚基中的任何一个功能失调,都有可能影响整个INO80复合物的生物功能。YY1是细胞内广泛存在的转录因子,也是人源INO80复合物的成员之一。我们前期研究证实,YY1亚基作为转录因子可以将INO80复合物募集到CDC6和GRP78两个靶基因的启动子区并激活该靶基因的转录。另有研究报道,miR-372 的启动子区含有两个 YY1 的结合位点,提示 YY1 有可能将 INO80 复合物募集到miR-372的启动子区并调控其转录过程。本论文以HeLa和HCT116细胞作为研究对象,通过构建pSingle-shINO80和pSingle-shArp8诱导基因沉默的细胞系、pLVX-shRNA 基因沉默质粒、pmR-mCherry-miR-372 的表达质粒、pMIR-INO80-3′-UTR-Luc和pMIR-Arp8-3′-UTR-Luc双荧光素酶的报告基因质粒,然后建立相应的细胞系和荧光报告酶检测系统,并结合DNA芯片多组学分析、网络数据库生物信息分析和一系列生物实验,阐明了 INO80复合物和miR-372间的互作及调控关系,为阐明miR-372和人源INO80复合物的生物学功能尤其是在一些肿瘤发生发展中的作用、进而为肿瘤的治疗提供了新的潜在治疗靶确认细节点。以下为本论文的主要工作与结果:1.利用pSingle-tTS-shRNA体系构建了 INO80和Arp8可诱导基因沉默的细胞系,并通过Dox(Doxycycline)诱导证实INO80和Arp8的表达降低,同时发现诱导沉默INO80后,细胞间粘附力增强,随着培养时间延长细胞呈现聚集性生长;另外,利用pLVX-shRNA慢病毒体系构建了 INO80、Arp8和YY1基因沉默质粒,并通过免疫印迹法证实其效果。以上质粒构建及其相应细胞系的建立为后续研究INO80复合物和miR-372间的相互作用关系奠定了实验基础。2.为了宏观了解INO80复合物在细胞内的生物学功能,利用siINO80、siIes2、siIes6、siArp5和siArp8分别沉默相应基因后,提取总RNA并进行了转录组(Transcriptome)高通量测序分析。Gene Ontology(GO)功能注释分析提示INO80复合物与细胞的增殖、生长、粘附、周期和分化等密切相关。另外,在基因表达谱分析中发现miR-372可以被上述五个亚基共同调控。进一步,通过UALCAN网站分析发现INO80复合物的多个亚基包括INO80、YY1、Arp8、INO80D和MCRS1的3′-UTR区域都含有miR-372相近的互补序列,提示INO80复合物与miR-372间存在相关性。3.利用siRNA、pLVX-shRNA或pSingle-shRNA可诱导基因沉默细胞系沉默INO80、Arp8、YY1或Ies2后发现均上调细胞内miR-372的表达水平,提示INO80/YY1复合物可能结合在miR-3 72转录起始位点上游并参与调控miR-372的转录过程。同时,将构建好的pri-miR-372的表达质粒瞬时转染至HCT116结肠癌细胞中,48小时后检测了包括INO80和Arp8在内的多个miR-372可能靶向调控的mRNAs及其蛋白表达水平。如所预期,实验结果显示,过表达pri-miR-372可以抑制INO80和Arp8的表达水平,表明miR-372可以靶向调控INO80复合物中多个亚基的表达水平。4.通过 UALCAN 网站预测并发现在 INO80-3′-UTR(153-159 和 4644-4650)和Arp8-3′-UTR(457-463和1594-1601)区域中分别有两个结合位点。利用pMIR-REPORT-Luc载体构建了含有这几个靶序列(或突变了的靶序列)的INO80-3′-UTR和Arp8-3′-UTR荧光素酶的报告基因质粒,然后在HCT116结肠癌细胞中检测了 miR-372对双荧光素酶活性的影响。结果表明,miR-372显著抑制 pMIR-INO80-3′-UTR-Luc/pMIR-Arp8-3′-UTR-Luc 荧光素酶活性,而这一作用因突变miR-372的结合位点而消失,证明miR-372通过与INO80和Arp8的3′-UTR区域中的靶序列直接结合,进而转录后调控INO80和Arp8的表达水平。5.在pSingle-shINO80可诱导细胞系中加入Dox诱导INO80沉默后,发现p53和p21的蛋白表达水平增高。而在HCT116selleck产品细胞中,过表达miR-372不仅引起INO80蛋白表达水平降低,同样导致p53和p21蛋白表达水平增高。因此,推测miR-372可能通过抑制INO80复合物来诱导p53和p21的表达,进而抑制细胞的增殖。另外,对原发性结肠癌患者组织样本的研究数据也证实低表达miR-372的结肠癌组织中,增殖细胞相关抗原Ki67的表达量明显增多,提示miR-372参与调控结肠癌细胞的增殖过程。利用HCT116细胞进行的集落形成实验也证实了这一推测。如所预期,无论是沉默INO80还是过表达miR-372都可以明显抑制细胞集落形成数量,而当miR-372与其抑制剂共同使用则拮抗了 miR-372对细胞集落形成的抑制作用,说明miR-372-INO80复合物可能协同参与结肠癌细胞的增殖过程。综上所述,本论文的实验结果揭示了 miR-372和INO80染色质重塑复合物间的相互调控关系;明确了 miR-372可以与INO80和Arp8的3′-UTR区域中的靶序列直接结合,从而转录后调节INO80复合物的表达和稳定性,这又进一步影响了 INO80复合物在细胞内的生物功能。hepatocyte transplantation本论文的研究结果为阐明INO80染色质重塑复合物的生物学功能及其机制提供了理论依据,并为后续癌症治疗药物的开发提供了新思路,miR-372也有望成为癌症早期诊断的生物标志物。