研究背景:视神经脊髓炎谱系疾病(neuromyelities optica spectrum disorder,NMOSD)是一种免疫系统介导的中枢神经系统(central nervous system,CNS)疾病。水通道蛋白4(Aquaporin 4,AQP4)抗体的发现,使genetic loadNMOSD从自身脱髓鞘性疾病归类为自身免疫性星形胶质细胞疾病。AQP4是一种细胞膜上驱动双向渗透的水通道蛋白,在血管周围和星形胶质细胞足突以及室管膜细胞中高度表达。神经病理学、动物实验和临床研究提供了大量证据证明AQP4抗体(AQP4-Ig G)参与NMOSD发病,更多深入的机制仍待探究。高通量蛋白质组学测序是一种客观有效量化蛋白的技术手段,能够从下游的小分子层面深入了解疾病发展过程,在蛋白质的定位、翻译后修饰、蛋白质-蛋白质相互作用(Protein-protein interaction,PPI)以及个体特定生理或病理变化等方面都具有研究意义。蛋白质组学能够识别生物在某段时期的全部蛋白质,可能是细胞、组织或器官乃至一种生物的大部分遗传信息,既可以为临床研究提供假设,又可以解释相关疾病的生物学改变。它的作用不仅仅是发现蛋白质,而是根据疾病背景,通过所涉及有效的驱动蛋白来描绘疾病在发生发展过程中的分子机制。胰岛素样生长因子2(Insulin-like growth factor 2,IGF-2)是胚胎发育期间调节生长的关键蛋白,其结构和调节机制庞大而复杂。在小鼠出生后,IGF-2在所有组织中的表达迅速下降,但在大脑中,特别是海马体中可持续性表达。有研究表明IGF-2参与大脑记忆、学习过程和神经元的可塑性调节,通过结合相关受体抑制细胞凋亡来调控神经元的存活。在许多神经系统疾病如多发性硬化(Multiple sclerosis,MS)、帕金森病(Parkinson’s disease,PD)和阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)中具有神经保护作用。本研究以NMOSD患者和正常对照者血清的蛋白质组学测序,筛选显著差异蛋白为研究手段;构建体内和体外实验模型验证筛选得到的差异蛋白IGF-2的功能;探究IGF-2对NMOSD的效用机制。为NMOSD的发病机制及治疗手段的探索提供理论依据及研究基础。研究方法:1.收集临床患者血清样本,通过数据非依赖采集(data independent acquisition,DIA)定量技术联合液相串联质谱法(high performance liquid chromatography-electrospray tandem mass spectrometry,LC-MS/MS)筛选分析各组间的差异蛋白。对筛选分析后的差异蛋白进行免疫印迹(Western blot,WB)实验验证。2.构建AQP4-Ig G损伤的星形胶质细胞模型,应用免疫荧光、实时荧光定量聚合酶链式反应(Real Time Quantitative Polymerase Chain Reaction,RT-q PCR)及蛋白免疫印迹(Western Blot,WB)方法检测星形胶质细胞生存、凋亡相关因子的表达情况。在星形胶质细胞内过表达IGF-2并给予胰岛素样生长因子1受体(Insulin-like growth factor-1 receptor,IGF-1R)抑制剂苦鬼臼毒素(PPP)后再次验证,探究IGF-2对于下游信号通路的影响。3.脑内注射AQP4-Ig G和人补体(human Complement,h C)构建NMO动物模型,观察小鼠的体重和运动评分变化,提取小鼠脑、脊髓组织制作切片进行免疫荧光检测相关蛋白表达,提取脑、脊髓内的总RNA和总蛋白,应用RT-q PCR和WB验证相关因子的表达,探究IGF-2对NMO小鼠的影响。4.A340 nm吸光光度法检测NMO小鼠脑、脊髓组织内谷氨酸(Glutamate,Glu)的含量变化。细胞免疫荧光实验检测细胞内兴奋性氨基酸转运蛋白2(Excitatory amino acid transporter 2,EAAT2)的表达,探究IGF-2对Glu含量的影响。研究结果:1.血清蛋白组学分析获得显著差异蛋白IGF-2、IGFBP-3和IGFBP-6。与正常对照组比较,NMOSD患者血清中IGF-2表达明显降低,IGFBP-3和IGFBP-6表达增加(p<0.05);RTX治疗后,IGF-2表达较NMOSD患者增加,IGFBP-3和IGFBP-6表达降低(p<0.05);IGF-2的降低倍数与患者EDSS评分呈正相关(R~2=0.8825,p<0.05)。2.成功从NMOSD患者和正常对照者血清中提取AQP4-Ig G/Con-IgPI3K/Akt/mTOR抑制剂 G,构建体外AQP4-Ig G损伤星形胶质细胞模型。AQP4-Ig G作用星形胶质细胞后IGF-2和IGF-1R的表达降低,抑制下游PI3K/AKT信号通路,促进星形胶质细胞凋亡和细胞内促炎因子的释放(p<0.05)。在星形胶质细胞内过表达IGF-2后,IGF-1R表达增加,激活下游PI3K/AKT信号通路,降低促凋亡蛋白表达及促炎相关因子的释放。给予IGF-1R抑制剂PPP后IGF-1R/PI3K/AKT信号通路受到抑制。3.小鼠脑内注射AQP4-Ig G和h C构建NMO小鼠模型,实验期间小鼠体重明显下降,运动功能受损(p<0.05)。小鼠提前脑内注射载有IGF-2的腺病毒后再进行NMO造模,体重和运动功能变化与对照组小鼠无显著差异(p>0.05),造模后应用RTX治疗的阳性对照小鼠,体重较治疗前无明显变化,但运动功能较前有所恢复(p<0.05)。4.AQP4-Ig G作用星形胶质细胞损伤Glu稳态,细胞上清和细胞内Glu的含量均明显增加(p<0.01)。过表达IGF-2后AQP4-Ig G作用星形胶质细胞使细胞上清中的Glu含量降低,细胞摄取Glu的能力较模型组有所恢复(p<0.05)。过表达IGF-2加入PPP的星形获悉更多胶质细胞内Glu含量较IGF-2组增加。IGF-2降低NMO小鼠脑、脊髓内的Glu含量(p<0.01)。研究结论:1.NMOSD患者血清中IGF-2显著降低,与患者临床症状严重程度相关。2.IGF-2激活IGF-1R/PI3K/AKT信号通路,抑制促炎因子释放,减轻中枢神经系统炎症反应和髓鞘缺失,预防NMO小鼠运动功能损伤。3.IGF-2减少过量谷氨酸蓄积在中枢神经系统,具有改善细胞活性和减轻神经兴奋性毒性等保护作用。