目的:CircRNAs与肿瘤的发生发展有着密切的关系,然而,circRNAs在获悉更多胃癌的诊断和进展中的确切作用机制尚不完全清楚。本研究旨在挖掘胃癌患者circRNA数据库中差异明显的hsa＿circ＿0007991(circ7991)分子,建立定量的检测方法,明确与胃癌患者的临床病理资料特征相关性,为胃癌的诊断与预后判断提供新的生物标志物;深入研究circ7991在胃癌恶性进展过程中确切作用及调控机制,为胃癌的治疗提供新的靶点。方法:1.应用GEO生物数据库中胃癌患者组织circRNA和患者血浆circRNA的芯片数据结果进行相关信息学分析,筛选出在胃癌组织中异常表达的circRNAs。应用定量逆转录聚合酶链反应(q RT-PCR)验证在胃癌组织中差异低表达的hsa＿circ＿0007991(circ7991)。核质分离后q RT-PCR及RNA荧光原位杂交(RNAFISH)检测circ7991分子在胃癌细胞中的表达分布,对circ7991进行表征分析和统计学评估其表达水平与胃癌患者临床病理学特征之间的相关性。2.构建过表达circ7991的质粒以及敲减circ7991的小干扰RNA,在胃癌细胞株中通过实时荧光定量PCR方法检测circ7991过表达和敲减后的表达效率,采用生长曲线、克隆形成、Transwell实验来测定circ7991对胃癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力的影响;流式细胞术(FCM)检测方法分析circ7991对胃癌细胞系凋亡和周期的影响;在BALB/c裸鼠皮下和腹腔注射胃癌细胞建立皮下成瘤以及胃癌转移模型,以此判断circ7chronic otitis media991在体内对胃癌细胞的增殖和转移能力的作用。采用免疫组化(IHC)方法测定相关分子指标在肿瘤组织中的表达情况。3.采用TRAP实验、质谱分析(MS)结合免疫共沉淀实验(Co-IP)筛选出与circ7991结合的目标蛋白分子。RNA免疫沉淀实验验证circ7991与结合蛋白δ-catenin之间的相互作用。Western blot检测δ-catenin蛋白在胃癌肿瘤组织中的表达,使用蛋白酶体抑制剂MG132和蛋白合成抑制剂放线菌酮CHX预处理过表达circ7991的胃癌细胞,Western blot和泛素化实验检测δ-catenin蛋白表达水平、半衰期以及泛素化水平的影响。利用免疫共沉淀和MS筛选鉴定TRIM25与circ7991/δ-catenin之间的相互作用。4.采用Circbank、Circ Interactome、mi RDB和Star Base V2.0等多个生物信息学软件预测与circ7991可能结合的miRNA目标分子。构建circ7991双荧光素酶报告基因的载体,合成可能结合的miRNA mimics,通过荧光素酶报告基因技术筛选出目标miRNA。构建与miRNA具体结合位点突变的circ7991报告基因的相关载体,进一步检测确认circ7991与可能结合的miRNA的结合位点区域。把circ7991过表达质粒和可能结合的miRNA mimics一起转染到胃癌细胞株之后,采用生长曲线、克隆形成MLN4924分子量和Transwell实验研究两者之间是否存在相互作用及胃癌细胞功能的改变。5.通过RNA测序和多个生物信息学分析预测对miRNA可能作用的靶基因,通过对RNA测序富集分析circ7991可能参与的信号通路,运用双荧光素酶报告基因实验、Western blot实验以及细胞学相关实验进一步研究分析miRNA对目标基因的靶向作用。结果:1.GEO数据库中选取了在癌组织中差异低表达的circRNA分子,根据分子表征以及在胃癌组织、细胞中的表达情况最终确定circ7991作为我们后续的研究对象。Circ7991在胃癌组织、血清中呈低表达水平,生存曲线分析结果显示胃癌患者中高表达的circ7991有较好的总体生存。Circ7991由亲本基因EIF4G3的第3-5号外显子的线性转录本通过反向剪切拼接而成。RNA-FISH和核质分离实验结果显示circ7991在细胞质和细胞核都有分布。2.生长曲线、平板克隆形成、Transwell实验结果显示在胃癌细胞中circ7991的高表达能够抑制胃癌细胞的增殖、迁移和侵袭,FCM结果显示过表达circ7991后促进胃癌细胞的凋亡。体内动物实验模型中过表达circ7991能够缩小皮下肿瘤体积。3.TRAP实验、MS结合RIP实验筛选鉴定circ7991和候选蛋白δ-catenin能够特异性的结合,利用RIP反向验证了胃癌细胞circ7991和δ-catenin的结合。过表达circ7991不影响δ-catenin mRNA的表达,但会降低δ-catenin蛋白的表达水平,同时MG132和CHX实验提示circ7991可能通过抑制δ-catenin蛋白的泛素化水平进而介导δ-catenin的降解。Co-IP实验结合质谱技术筛选鉴定TRIM25在δ-catenin的泛素化降解中发挥关键性作用的E3连接酶。4.RNA结合蛋白免疫沉淀的相关实验结果表明,circ7991能够结合RISC复合体的关键成分即AGO2蛋白。通过多个生物信息学分析和双荧光素酶实验报告基因证实circ7991与mi R-4449之间存在结合位点。细胞回补实验显示mi R-4449 mimics可以部分逆转circ7991过表达对胃癌细胞的抑制作用。5.Circ7991过表达测序结果中参与β-catenin通路的相关基因,结合生物信息学预测的靶基因,结果表明SIK1可能受mi R-4449调控。双荧光素酶报告基因结果证实mi R-4449和SIK1之间存在结合位点。在胃癌组织中circ7991和SIK1的表达呈正相关关系。细胞增殖和Transwell实验显示下调SIK1的表达后能够部分回补由circ7991过表达所导致的胃癌抑制作用。结论:Circ7991在胃癌中低表达与胃癌患者的预后差密切相关;体内外实验结果表明过表达circ7991能够抑制胃癌细胞的增殖、迁移和侵袭;其分子机制为:(1)circ7991通过E3泛素连接酶TRIM25特异性结合δ-catenin蛋白并促进其泛素化和降解;(2)circ7991可作为mi R-4449的分子海绵上调SIK1的表达,导致β-catenin通路失活进而影响肿瘤的进展。我们的研究表明,在胃癌的诊疗中,circ7991具有新的诊断与预后标志物和治疗靶点的潜能。