【背景】胃癌是世界范围内发病率第五,死亡率第四的恶性肿瘤,是fatal infection我国最常见的消化系统恶性肿瘤。据国家癌症中心2020年数据,我国胃癌的发病率和死亡率均位居所有恶性肿瘤的第三位。化疗是胃癌临床治疗的基础性手段。对于II-III期胃癌,围手术期化疗能显著缩小肿瘤体积,提高无进展生存率和总生存率;对于IV期胃癌,姑息性化疗能够给患者带来更长的生存时间和更好的生活质量。然而,化疗耐药常伴随化疗发生,是导致胃癌治疗失败的重要原因。核不均一核糖核蛋白A2B1(heterogeneous nuclear ribonucleoprotein A2B1,hnRNPA2B1)属于RNA结合蛋白,同时也是m~6A甲基化修饰识别蛋白,可参与RNA合成、加工、转运、降解等各个阶段,进而影响多种靶基因的表达。文献报道,hnRNPA2B1在多种肿瘤中表达上调,通过影响下游靶RNA参与肿瘤的增殖、侵袭、转移等恶性进展。但是,hnRNPA2B1在胃癌中的研究较少,其是否参与胃癌的恶性进展,尤其是参与胃癌化疗耐药目前尚不清楚。【目的】1、探究hnRNPA2B1在胃癌细胞系、胃癌临床组织及胃癌化疗耐药细胞系中的表达情况,分析hnRNPA2B1在胃癌中的预后价值。2、明确hnRNPA2B1在胃癌化疗耐药中发挥的作用,探究hnRNPA2B1过表达或功能缺失对胃癌细胞化疗耐药性的影响。3、阐明hnRNPA2B1在胃癌化疗耐药中发挥作用的具体机制,为解决胃癌化疗耐药提供新的理论依据和研究基础。【方法】1、应用生物信息学分析,探究hnRNPA2B1在泛癌中的表达及预后价值;利用Western blot、q PCR、免疫荧光和免疫组织化学染色检测hnRNPA2B1在胃癌细胞系、胃癌临床组织及胃癌化疗耐药细胞系中的表达情况;运用Kaplan-MeierPlotter数据库分析hnRNPA2B1在胃癌中的预后价值。2、利用慢病毒感染技术分别在胃癌细胞系中上下调hnRNPA2B1,建立hnRNPA2B1功能获得与缺失细胞模型;分别通过半抑制浓度(IC50)实验、细胞生长曲线、流式凋亡检测、Western blot实验、裸鼠皮下成瘤耐药实验、免疫组织化学染色等方法,在体内外探究hnRNPA2B1过表达或功能缺失对胃癌细胞增殖能力和化疗耐药性的影响。3、将hnRNPA2B1敲减稳转细胞系与对照细胞行转录组测序分析,结合紫外交联免疫沉淀(CLIP-seq)的数据库结果,筛选出可能与hnRNPA2B1相结合的分子。利用RNA免疫共沉淀实验(RIP),检测hnRNPA2B1与lnc RNA NEAT1的结合能力。应用q PCR和Western blot,检测过表达或敲低hnRNPA2B1对NEAT1的表达影响。应用RNA稳定性实验,检测放线菌素D处理后,hnRNPA2B1对NEAT1稳定性的影响。设计并构建NEAT1的反义寡核苷酸(ASO)载体,在胃癌细胞系中下调NEAT1,建立NEAT1功能缺失细胞模型;分别通过绘制细胞生长曲线、半抑制浓度(IC50)实验探究NEAT1功能缺失对胃癌细胞增殖能力和化疗耐药性的影响。应用RNAscope原位杂交实验,检测hnRNPA2B1与NEAT1在胃癌临床组织中的表达及定位。4、应用细胞成球实验检测过表达或敲低hnRNPA2B1,对胃癌细胞成球能力的影响。应用q PCR和Western blot,检测过表达或敲低hnRNPA2B1,及敲低NEAT1对胃癌细胞干性标志物表达的影响。应用多重免疫组化染色实验检测肿瘤干性标志物CD133、CD44在胃癌临床组织中的表达。【结果】1、通过生物信息学分析,发现hnRNPA2B1在多种肿瘤中高表达;应用单因素COX回归和Kaplan-Meier生存分析探究hnRNPA2B1在泛癌中的预后价值,发现hnRNPA2B1高表达与多种肿瘤的不良预后相关。Western blot、q PCR及免疫荧光验证了hnRNPA2B1在多种胃癌细胞系中表达升高,且胃癌化疗耐药细胞的表达水平较亲本细胞显著升高。通过免疫组织化学染色在胃癌组织芯片中进行验证,发现hnRNPA2B1在胃癌组织中的表达水平显著高于癌旁组织。进一步通过数据库分析,发现hnRNPA2B1与胃癌患者的预后密切相关,并且与氟尿嘧啶化疗患者的不良预后相关。2、Western blot和q PCR验证了病毒感染可以有效下调hnRNPA2B1在SGC7901~(ADR)和SGC7901~(VCR)细胞中的表达水平,上调hnRNPA2B1在SGC7901细胞中的表达水平。IC50实验、细胞生长曲线、流式凋亡检测、Western blot等实验表明,敲低hnRNPA2B1降低了胃癌耐药细胞株对化疗药物的耐药性,升高hnRNPA2B1提高了细胞对化疗药物的耐药性。裸鼠皮下成瘤耐药实验表明,敲低hnRNPA2B1抑制体内肿瘤生长,降低胃癌细胞的化疗耐药性,进行免疫组织化学染色发现,Ki-67染色阳性细胞比例显著降低,Cleaved Caspase-3染色阳性细胞比例显著增加。3、转录组测序分析结合CLIP-seq数据库,筛选出可能与hnRNPA2B1相结合的分子lnc RNA NEAT1。RIP实验证明,hnRNPA2B1能显著富集NEAT1。q PCR证明下调hnRNPA2B1可以降低NE确认细节AT1的表达。RNA稳定性实验表明hnRNPA2B1可维持NEAT1的RNA稳定性。q PCR验证了ASO转染可以有效下调NEAT1在过表达hnRNPA2B1的SGC7901细胞中的表达水平。细胞生长曲线和IC50实验表明,敲低NEAT1降低了胃癌细胞的增殖能力和对化疗药物的耐药性。挽救实验表明,NEAT1是hnRNPA2B1调控胃癌细胞化疗耐药的功能靶分子。在胃癌临床组织中进行RNAscope原位杂交实验,发现hnRNPA2B1与NEAT1共定位于细胞核,且hnRNPA2B1与NEAT1的表达在胃癌组织中相对于癌旁组织明显升高。4、对hnRNPA2B1基因表达水平和肿瘤干性评分进行Spearman相关性分析,结果表明hnRNPA2B1基因表达水平与肿瘤干性评分呈显著正相关。stemness checker数据库的干性基因集特征联合转录组测序结果,提示hnRNPA2B1可能通过调节肿瘤干性参与胃癌化疗耐药。细胞成球实验表明,在SGC7901~(ADR)和SGC7901~(VCR)细胞中下调hnRNPA2B1后,可以抑制细胞的体外成球能力,在SGC7901细胞中上调hnRNPA2B1后,促进胃癌细胞的体外成球能力。q PCR、Western blot及免疫荧光表明,在SGC7901~(ALY294002小鼠DR)和SGC7901~(VCR)细胞中下调hnRNPA2B1抑制胃癌细胞干性标志物的表达,在SGC7901和HGC27细胞中上调hnRNPA2B1促进胃癌细胞干性标志物的表达,在过表达hnRNPA2B1的SGC7901细胞中下调NEAT1,抑制胃癌细胞干性标志物的表达,在MGC803和BGC823细胞中,同样发现敲低NEAT1引起胃癌细胞干性标志物的表达降低。多重免疫组化染色实验表明,肿瘤干性标志物CD133、CD44在胃癌临床组织中的表达明显升高,且与hnRNPA2B1表达水平呈正相关。【结论】1、hnRNPA2B1在胃癌细胞、胃癌临床组织、胃癌化疗耐药细胞系中表达升高,并且与胃癌患者的不良预后和化疗耐药相关。2、hnRNPA2B1可在体外和体内促进胃癌细胞生长和化疗耐药,抑制胃癌细胞凋亡。3、hnRNPA2B1可与lnc RNA NEAT1直接结合,并维持其稳定性参与胃癌化疗耐药。4、hnRNPA2B1可能通过调控胃癌细胞干性参与胃癌化疗耐药。