非洲猪瘟(African swine fever,ASF)是由非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)引发的猪急性传染病,具有传播速度快、致死率极高和防控困难的特点,给我国养猪业造成巨大经济损失,被列为一类疫病。但是目前针对该病尚缺乏有效的疫苗和药物。ASFV是一种双链DNA虫媒病毒,编码60种以上的结构蛋白和100余种非结构蛋白。其中非结构蛋白E165R具有三磷酸脱氧尿苷酶(d UTPase)功能,在病毒复制中提供能量,对ASFV复制具有重要作用。G-四链体(G4)是一种由富含鸟嘌呤碱基的DNA或RNA形成的特殊核酸二级结构,该结构普遍存在于真核生物、原核生物以及病毒基因组上,在DNA复制、基因转录和蛋白表达等方面发挥着重要调控作用。越来越多的研究报道G4结构调控病毒复制,成为潜在的抗病毒靶点。本研究通过生物信息学分析发现E165R基因的蛋白编码区(CDS)存在一段富含鸟嘌呤的序列,预测能够形成G4结构。为了在实验上验证G4结构形成,本论文首先合成E165R基因富含G序列及其突变序列E165R-G4和E165R-G4M并采用丙烯酰胺凝胶电泳和CD鉴定G4结构形成。结果显示,在含有尿素的变性胶中G4和G4M有相同的迁移率,而在非变性胶中G4因为形成结构更加紧凑有着更快的迁移率。CD实验结果显示,含K~+的G4在240 nm处存在负峰,在260 nm存Ischemic hepatitis在正峰,这是平行型G4结构的典型现象,含K~+的G4因为有阳性离子存在结构更加稳定从PCI-32765而现象更明显。为进一步验证结构形成利用G4特异性小分子稳定剂NMM进行荧光分析实验,结果显示,在K~+存购买diABZI STING agonist在下的G4结构其NMM的荧光更强,Li~+存在的G4和G4M荧光信号相对更弱。这些结果说明E165R基因的G4结构能在体外形成。本论文接下来研究G4稳定剂PDS和TMPyP4是否能结合并稳定G4结构。将DNA与不同浓度稳定剂结合进行荧光能量共振转移(FRET)实验,结果表明随着稳定剂的增加,打开G4结构所需的能量越来越高,这说明PDS和TMPyP4能够提高G4结构的热稳定性。Taq酶延伸阻滞实验结果表明,PDS和TMPyP4稳定G4结构阻碍了Taq酶在DNA模板上延伸。本论文接下来研究E165R基因形成的G4结构的生物学功能。借助G4结构抗体BG4通过免疫荧光实验证实E165R-G4能在细胞内形成G4结构。通过将G4和G4M序列分别插入GFP蛋白起始密码子后面构建G4-WT-GFP和G4-MUT-GFP质粒。流式细胞术和细胞荧光检测结果表明PDS和TMPyP4抑制了GFP蛋白的表达。接着为了研究G4对E165R基因表达的影响,在E165R基因后插入FLAG标签构建了E165R-FLAG质粒。WB和RT-q PCR实验结果表明E165R蛋白受G4结构影响被抑制但m RNA水平没有变化,这表明G4稳定剂不影响蛋白的转录。接着本论文合成了E165R-G4的RNA序列,CD和NMM荧光开启实验证实该序列能够形成稳定的平行型RNA G4结构。上述结果表明ASFV E165R基因能够形成RNA G4结构,并且G4稳定剂PDS和TMPyP4能够通过该结构调控E165R基因的表达。本论文发现E165R基因的富含G序列能够在体外及细胞内形成G4结构,G4稳定剂PDS和TMPyP4能够结合并且稳定G4结构。进一步研究发现G4稳定剂通过影响转录后阶段调控E165R基因表达。该发现阐明了G4结构对E165R基因表达的调控机制,为防控ASFV提供了新思路。