研究背景和目的宫颈癌(Cervical cancer,CC)是危害女性生命健康的重要原因之一,也是造成女性癌症死亡的第四大原因。近年来,随着宫颈癌筛查的普及和HPV疫苗的接种,发达国家的宫颈癌发病率已经大幅度降低,但是对于经济比较落后的发展中国家而言,宫颈癌发病率仍然呈现上升趋势。通常,早期宫颈癌可以通过手术进行治疗且临床效果显著,而对于晚期或复发性宫颈癌患者来讲,预后明显变差。放疗联合含铂化疗被认为是晚期或复发性宫颈癌的标准治疗方法,然而顺铂耐药的发生严重阻碍了其在临床中的应用。因此,阐明宫颈癌的发生发展机制、探寻新的治疗方法、提高宫颈癌细胞对顺铂的敏感性是十分必要的。上皮细胞转化序列 2(Epithelial cell transforming sequence 2,ECT2)是一种鸟嘌呤核苷酸解离交换因子,位于人类肿瘤染色体经常发生改变的3q26区域。ECT2与人类癌症的多种恶性表型和化疗耐药相关,参与细胞的增殖、转移、有丝分裂、凋亡、DNA损伤修复和肿瘤发生的信号转导途径。ECT2在多种癌症中表达升高,但是ECT2在宫颈癌发生发展和化疗耐药中的作用尚不清楚。因此本研究的主要目的如下:(1)验证ECT2在宫颈癌中的表达情况;(2)探索ECT2对宫颈癌恶性表型的影响;(3)探究ECT2对宫颈癌顺铂耐药的影响;(4)阐述ECT2作为原癌基因发挥促癌作用的上、下游机制。研究方法1.利用生信分析在TCGA和GEO数据库中获得与宫颈癌发生发展及顺铂耐药密切相关的基因,经过文献回顾确定待研究的基因ECT2。通过免疫组化实验验证ECT2在宫颈癌和正常宫颈组织中的表达情况,利用RT-qPCR进一步检测ECT2在宫颈癌组织和宫颈癌细胞系中的表达,并使用Keplan-Meier在线网站预测ECT2对宫颈癌患者预后的影响。2.验证ECT2对宫颈癌恶性表型的影响。首先,构建ECT2过表达(PCMV-ECT2)和敲减(sh-ECT2)的Ca Ski和HeLa稳转细胞,或者通过转染小干扰(si-ECT2)瞬时敲低宫颈癌细胞ECT2的表达。然后,通过CCK-8和裸鼠成瘤实验验证ECT2对宫颈癌细胞增殖能力的影响,采用Transwell实验和划痕实验检测ECT2对细胞迁移和侵袭能力的影响,进行流式凋亡实验和Western Blot实验验证ECT2对细胞凋亡能力的影响。3.验证ECT2在宫颈癌顺铂耐药细胞中的表达。通过CCK-8实验检测ECT2敲减后顺铂对细胞活力的影响以及IC50的变化,利用平板克隆实验观察细胞克隆数目验证ECT2敲低对顺铂抗增殖作用的影响,通过流式凋亡实验验证ECT2敲低对顺铂治疗导致的细胞凋亡作用的影响,进行裸鼠皮下成瘤实验体内探究敲低ECT2对宫颈癌细胞顺铂敏感性的影响。4.利用高通量转录组测序找寻ECT2发挥促癌作用的下游通路AKT/mTOR,通过Western Blot和免疫共沉淀(Co-IP)实验验证ECT2对下游通路的调控作用,并通过挽救实验验证敲低AKT对过表达ECT2导致的促增殖、迁移、侵袭和抑凋亡作用的影响。通过JASPER数据库预测ECT2的上游转录因子,生信分析验证NFYA与ECT2的表达关系,并采用RT-qPCR、Western Blot和双荧光素酶报告基因实验验证NFYA对ECT2的调控作用,最后通过挽救实验进一步证明ECT2和上游转录因子NFYA的关系。研究结果1.免疫组化实验结果显示,与正常宫颈组织相比,ECT2在宫颈癌组织中表达上调,RT-qPCR在证实这一PR-171结论的同时还发现ECT2在宫颈癌细胞系中表达增多(P<0.05)。此外,Keplan-Meier在线预测网站显示ECT2高表达的宫颈癌患者与低表达患者相比其无复发生存期短(P=0.023)。2.体外实验证明,过表达ECT2可以促进宫颈癌细胞的增殖、侵袭和迁移,抑制细胞的凋亡,并且减少凋亡相关蛋白的表达,而敲减ECT2之后结果相反,且差异均具有统计学意义;体内实验证明,与对照组相比,ECT2过表达组可以促进宫颈癌细胞裸鼠成瘤能力(P<0.05)。3.ECT2在宫颈癌顺铂耐药细胞中表达上调。CCK-8实验表明顺铂梯度加药后,ECT2敲减组宫颈癌细胞活性受损更明显且迅速;平板克隆实验显示ECT2敲减可以增强顺铂对细胞增殖能力的抑制作用;流式凋亡实验表明ECT2敲低可以促进顺铂导致的细胞凋亡作用;裸鼠成瘤体内实验证明了敲低ECT2可以提高宫颈癌细胞对顺铂的敏感性,增强化疗疗效,且上述结果均具有统计学意义。4.高通量转录组测序、Co-IP和Western Blot实验显示ECT2可以与AKT直接结合形成ECT2/AKT复合物从而激活AKT/mTOR通路发挥促癌作用,抑制AKT的表达可以挽救ECT2过表达导致的促增殖和抑凋亡作用(P<0.05)。JASPER数据库预测ECT2启动子区域的转录因子NFYA的结合位点,生信分析发现NFYA在宫颈癌中表达上调且与ECT2表达呈正相关,RT-qPCR、Western Blot和双荧光素酶报告基因实验阐明了 NFYA对ECT2的调控作用,CCK-8、Transwell和流式凋亡实验证明了敲低NFYA后可以挽救过表达ECT2导致的促增殖、迁移和抑凋亡等作用(P<0.05)。研究结论1.ECT2在宫颈癌细胞和组织中高表达,且ECT2高表达与患者不良预后相关;2.敲低ECT2可以抑制宫颈癌细胞的增殖、迁移和侵袭,促进细胞的凋亡能力;3.干microRNA biogenesis扰ECT2的表达可以提高宫颈癌细胞对顺铂的敏感性;4.ECT2可以与AKT直接结合激活AKT/mTOR通路并发挥下游促癌作用;5.转录因子NFYA通过调控ECT2的表达促进宫颈癌的恶性表型。本研究的创新性1.本研究通过体内、外实验证实了ECT2在宫颈癌发生发展中的促癌潜能,为找寻宫颈癌新的治疗靶点提供了理论基础;2.本研究创新性发现ECT2可以诱导宫颈癌的顺铂耐药,使得ECT2有望成为治疗宫颈癌顺铂耐药的新靶点;3.本研究阐明了ECT2可以与AKT直接结合,激活AKT/mTOR通路促进宫颈癌恶性表型的发生,为宫颈癌的发病机制提供新的思路;4.本研究阐述了转Caspase抑制剂录因子NFYA可以转录激活ECT2并促进ECT2表达,从而发挥下游的生物学功能。本研究的局限性1.本研究可以纳入更多数量的宫颈癌组织标本,以便分析ECT2与宫颈癌患者临床病理因素之间的关系;2.本研究中ECT2诱导宫颈癌顺钼耐药的具体机制未深入探讨,这将作为未来进一步的研宄方向;3.本研究尚处于临床前研究,将ECT2从实验阶段转化为临床应用仍需进一步的探索和实验。