草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)属鳞翅目(Lepidoptera)夜蛾科(Noctuidae),具有迁飞能力强、寄主范围广等特点,是我国重大入侵害虫、大田作物的重要防治对象。杀虫剂的大面积施用已导致害虫产生抗性,同时,化学残留亦是威胁环境和人类健康的重要问题,因此,生产上迫切需要开发安全高效的害虫防治策略。近年来,TALENs和CRISPR/Cas9等基因编辑技术针对性别比定向(Sex ratio distortion,SRD)和雌性致死系统(Female killing system,FKS)点击此处实现对雄性不育或雌性致死的精准调控极大促进了昆虫不育技术(Sterile insect technique,SIT)在鳞翅目害虫防治中的应用革命。本研究通过CRISPR/Cas9基因编辑技术探索草地贪夜蛾S.frugiperda doublesex(Sfdsx)基因作为性别分化和生殖调控中的功能性作用,明确dsx基因在草地贪夜蛾生殖发育中的作用以及在生物防治中的应用潜力,进而为草地贪夜蛾的防治提出安全有效的防治策略。具体的研究结果如下:1.首先鉴定并克隆了草地贪夜蛾Sfdsx基因,结果显示Sfdsx具有两种性别特异性剪接模式,且发现了4种不同的性别特异性可变剪接体(3种雌性和1种雄性特异性GSK1120212配制可变剪接体),Sfdsx雄性特异性剪接体的结构与典型的鳞翅目dsx可变剪接体相同,雄性特异性剪接体含有1号、2号和5号外显子,Sfdsx雌性特异性剪接体其含有所有的外显子,与其他鳞翅目昆虫的dsx结构相似,该部分结果确定了Sfdsx的可变剪接体是草地贪夜蛾性别的决定重要因素。2.通过分析Sfdsx与其他近缘昆虫的进化关系,发现草地贪夜蛾dsx与斜纹夜蛾(Spodoptera litura)、棉铃虫(Helicoverpa armigera)和亚洲玉米螟(Ostrinia furnacalis)等这些鳞翅目昆虫的氨基酸序列具有高度一致性。在系统发育树中,Sfdsx与鳞翅目昆虫具有很高的亲缘关系,与棉铃虫dsx同源性最高。此外,分析Sfdsx基因表达模式显示Sfdsx在草地贪夜蛾蛹期阶段表达量最高。3.我们在Sfdsx基因性别特异性的公共区域2号外显子设上计靶点对Sfdsx~C敲除,成功得到了Sfdsx~C的突变体。测序发现Sfdsx基因的2号外显子内有几个碱基对的丢失、插入或替换。在Sfdsx~C敲除后,草地贪夜蛾蛹突变率达到了38.5%,成虫突变率为41%,与野生型相比成虫突变体的雌雄的性别比为1:47。4.草地贪夜蛾Sfdsx基因性别特异性公共区域的敲除使得蛹期和成虫期表型均发生了突变,雌雄外生殖器都表现出偏向性别中间态的扭曲或突起。解剖突变体成虫的内生殖器后发现在Sfdsx~C突变体中,雌性和雄性突变体在Bioclimatic architecture卵巢和精巢上均表现出严重的结构性发育缺陷和内生殖器形态缺陷。5.为了研究Sfdsx基因在草地贪夜蛾生殖发育中的作用,我们设计了草地贪夜蛾的突变体的交配实验,结果表明:Sfdsx~C敲除后,草地贪夜蛾的生殖力显著降低,产卵率严重下降,低至72%,且卵的孵化率为0,因此Sfdsx基因的敲除导致草地贪夜蛾不育。此外,Sfdsx~C的敲除干扰了性别特异性生理活动中气味受体基因(Odor receptor,OR1)和信息素结合蛋白基因(Pheromone binding protein,PBP)的表达。OR1、PBP1和PBP2基因的表达在Sfdsx~C雄性突变体中显著下调,PBP1基因的相对转录水平在Sfdsx~C雌性突变体中则明显增加。