研究目的:帕金森病(Parkinson’s disease,PD)是目前位居全球第二的神经退行性疾病,也是增长最快的神经系统致残性疾病。该病主要病理改变为中脑黑质部位多巴胺能神经元丢失和嗜酸性包涵体(即路易小体)形成。帕金森病最典型的临床表现为运动迟缓、静止性震颤、肌强直和姿势步态障碍。60岁以上人群帕金森病的患病率约为1%,85岁以上人群帕金森病的患病率大于4%。随着人口老龄化和平均寿命的延长,帕金森病的患病人数还在逐年增加。该病不但严重威胁着老年人的身体健康和生活质量,而且给家庭和社会带来了沉重的经济负担。帕金森病病因复杂,发病机制尚不明确。目前主要通过药物治疗缓解症状,缺乏能够抑制疾病进展的根本治疗方法。因此,结合帕金森病发生机制积极探索疾病治疗的新药物、新方法可能会对帕金森病的预防和治疗带来帮助。近期研究提示铁死亡可能参与了帕金森病的发生发展过程。铁死亡是一种铁依赖性的细胞程序性死亡,与坏死、凋亡等死亡形式不同,在形态学方面发生铁死亡的细胞主要表现为线粒体体积缩小、膜密度增加及线粒体脊消失等改变。铁死亡的基本特点为铁依赖的脂质过氧化反应造成细胞内大量脂质过氧化物蓄积和氧化还原反应失衡,从而破坏和攻击生物大分子最终导致细胞死亡。它的发生过程主要受到铁代谢、脂代谢和谷胱甘肽代谢等方面的调控。当体内铁含量增多、脂质过氧化反应增强以及还原型谷胱甘肽(glutathione,GSH)等抗氧化系统失衡时均可继发铁死亡。近年来有研究人员发现帕金森病中存在铁超载、脂质过氧化物蓄积、活性氧(Reactive oxygen species,ROS)增多、GSH和谷胱甘肽过氧化物酶4(glutathione peroxidase 4,GPX4)降低等铁死亡相关的一些病理改变,提示铁死亡可能参与了帕金森病的发生发展过程,抑制铁死亡有望成为帕金森病治疗的新方向。Curcumin是一种从姜黄属植物的根茎中提取的多酚类化合物,是姜黄属植物发挥效应的主要化学成份,也被认为是药理活性最强的单体化合物。早期一些研究证实curcumin具有强大的抗氧化活性和亲脂性特点,它可以穿透血脑屏障,对脑卒中等多种中枢神经系统疾病具有保护作用。近年来,它在预防或延缓神经退行性疾病方面的应用也逐渐受到关注。但是curcumin是否能通过抑制铁死亡对帕金森病发挥神经保护作用尚不清楚。本研究应用6-羟基多巴胺(6-hydroxydopamine,6-OHDA)诱导建立帕金森病动物和细胞模型,通过体内和体外实验深入了解帕金森病中铁死亡的发生情况,探究curcumin对帕金森病中铁死亡的具体作用和机制。研究方法:第一部分首先采用脑立体定位注射6-OHDA的方法建立帕金森病动物模型。确认造模成功后,通过行为学、HE染色、免疫组织化学染色和免疫印迹实验方法对curcumin的治疗效果进行验证并筛选出最佳治疗剂量。然后通过普鲁士蓝染色、免疫印迹、透射电镜、丙二醛(Malondialdehyde,MDA)和GSH试剂盒对组织中铁离子、铁死亡相关蛋白、线粒体形态、MDA和GSH含量进行检测,探究6-OHDA诱导的帕金森病大鼠模型中铁死亡的发生情况及curcumin对其的调控作用。第二部分首先用Erastin诱导MN9D细胞发生铁死亡,通过台盼蓝染色明确curcumin对铁死亡是否具有抑制作用。然后利用6-OHDA诱导MN9D细胞建立帕金森病模型,通过免疫印迹、透射电镜、流式细胞术、MDA和GSH试剂盒检测观察不同浓度curcumin对细胞中铁死亡相关蛋白、线粒体形态、ROS等的影响,进一步明Berzosertib分子式确curcumin对6-OHDA诱导的MN9D细胞中铁死亡的调控作用。第三部分建立帕金森病动物模型,用蛋白免疫印迹方法检测分析Nrf2、ATF3及SLC7A11在帕金森病大鼠黑质中的表达。接着在6-OHDA诱导的MN9D细胞模型中,用小干扰RNA敲减Nrf2,通过RT-q PCR和免疫印迹方法检测Nrf2和SLC7A11在m RNA和蛋白水平的表达变化。然后通过蛋白免疫印迹、倒置荧光显微镜、流式细胞术和透射电镜对细胞中铁死亡相关蛋白、ROS及线粒体形态进行检测,用CCK8试剂盒对细胞活性进行检测,探究curcumin调控铁死亡对帕金森病模型发挥神经保护作用的具体机制。结果:1、6-OHDA造模大鼠30min内向健侧转圈数大于210r较对照组明显增多;造模大鼠病损侧黑质区神经元排列疏松、TH阳性神经元表达较健侧显著减少,以上结果均提示造模成功。2、中、高剂量curcumin治疗组大鼠向健侧转圈数较模型组明显减少,中、高剂量curcumin治疗可以减轻帕金森病大鼠神经元病理损伤,增加大鼠纹状体和黑质部位TH蛋白表达,并且二者的作用效果相当。3、蛋白免疫印迹结果提示模型组大鼠纹状体和黑质部位GPX4、FTH1和SLC7A11表达较对照组明显减低,PTGS2蛋白表达明显升高;与铁死亡抑制剂Liproxstatin-1(Lip-1)作用效果类似,curcumin治疗可以逆转以上铁死亡蛋白的表达。4、普鲁士蓝染色结果显示模型组大鼠纹状体和黑质部位铁沉积较对照组增加,透射电镜结果显示模型组大鼠黑质区神经元内线粒体较对照组体积缩小、线粒体脊断裂消失,curcumin治疗可以减少神经元内铁沉积,改善线粒体形态。5、MDA和GSH检测结果提示curcumin可以显著降低模型Autoimmune blistering disease组大鼠黑质部位MDA含量,提高GSH水平。6、台盼蓝染色结果显示curcumin可以减少Erastin诱导的MN9D细胞死亡,提示它对铁死亡具有抑制作用。7、与Lip-1作用效果类似,curcumin可以提升6-OHDA诱导的MN9D细胞中GPX4、FTH1和SLC7A11蛋白的表达,降低PTGS2的表达,且其作用效果呈浓度依赖性。与100n M和1μM组相比10μM curcumin可以显著降低6-OHDA诱导的MN9D细胞中MDA含量,提高GSH水平。8、与倒置荧光显微镜观察到的ROS探针荧光强度一致,流式细胞术定量检测结果显示6-OHDA诱导的MN9D细胞中ROS含量较对照组明显升高,1μM和10μM curcumin均可以显著降低细胞内ROS水平。9、蛋白免疫印迹结果提示帕金森病大鼠黑质部位总蛋白及核蛋白中Nrf2和SLC7A11的表达较对照组减低,curcumin治疗可以显著提升Nrf2和SLC7A11的表达;ATF3在模型组大鼠核蛋白中的表达较对照组增多,但是curcumin治疗并不能降低或改变6-OHDA造模大鼠总蛋白及核蛋白中ATF3的表达,提示ATF3不是curcumin调控6-OHDA诱导帕金森病大鼠中铁死亡的关键作用因子。10、转染Nrf2小干扰RNA降低6-OHDA诱导的MN9D细胞中Nrf2在m RNA和蛋白水平的表达;蛋白免疫印迹结果提示敲减Nrf2可以降低SLC7A11的表达,降低GPX4、FTH1蛋白表达同时增加PTGS2表达,逆转curcumin对6-OHDA诱导的MN9D细胞中铁死亡相关蛋selleck抑制剂白的表达调控作用。11、倒置荧光显微镜和流式细胞术定量检测结果提示敲减Nrf2后细胞内ROS水平升高,逆转了curcumin对模型组细胞中ROS的下调作用。12、6-OHDA诱导的MN9D细胞中线粒体体积缩小,线粒体脊断裂消失,curcumin治疗可改善线粒体形态,敲减Nrf2会逆转curcumin对细胞内线粒体的保护作用。13、CCK8检测结果提示敲减Nrf2可以加重6-OHDA诱导的MN9D细胞损伤、降低细胞活力,抑制curcumin对细胞的保护作用。结论:1、6-OHDA诱导的帕金森病大鼠模型中存在明显铁死亡,curcumin的神经保护作用与其对铁死亡的抑制密切相关。2、Curcumin可以降低细胞内ROS水平,改善线粒体形态和铁死亡相关蛋白等的表达,对6-OHDA诱导的帕金森病细胞模型中的铁死亡具有明显抑制作用。3、Curcumin治疗并不能降低或改变6-OHDA造模大鼠总蛋白及核蛋白中ATF3的表达;curcumin主要通过Nrf2/SLC7A11信号通路调控铁死亡对帕金森病模型发挥神经保护作用。