目的:胃癌发病率高、死亡率高,严重威胁着世界各国人民的Ceralasertib分子量生命与健康。最新公布的全球185个国家的癌症数据显示,全球每年大约有100万名新罹患胃癌的病人,与此同时,全球每年有近77万人因为胃癌而与世长辞。在我国,平均每分钟新发确诊1例胃癌,每3分钟约2人死于胃癌,为我国带来严重的经济负担与社会负担。胃癌原发灶的转移与扩散是导致胃癌病人治疗效果不佳的罪魁祸首,而淋巴结转移又是胃癌转移与扩散方式中最常见的一种。我们应用胃癌组织芯片发现CRIP1基因与胃癌淋巴结转移密切相关。CRIP1(富含半胱氨酸的肠蛋白1)属于Lin11、Isl-1、Mec-3(LIM结构)/双锌指蛋白家族,最早在小肠中被发现。CRIP1在胃癌中的研究尚处于起步阶段,其第一次在胃癌中被提及源自于Benjamin的一项研究,介绍了CRIP1可以作为一个全新的判断胃癌病人预后的独立因素。目前,CRIP1已经在甲状腺癌与结直肠癌等肿瘤中被证实可以促进淋巴结转移。淋巴结转移是指上皮来源的肿瘤细胞扩散进入淋巴管,并在淋巴管内跟随淋巴循环进入引流淋巴结并定植。近来,淋巴管在肿瘤淋巴结转移过程中的动态变化吸引了研究人员的关注。肿瘤中的淋巴管新生与淋巴管通透性的改变均可此网站以影响肿瘤的淋巴结转移,目前关于该领域的研究多集中于淋巴管新生中,而淋巴管通透性在淋巴结转移中的作用机制尚不明确。肿瘤微环境在淋巴结转移过程中扮演着重要角色,其与肿瘤细胞间的相互作用参与了肿瘤转移的全过程。作为肿瘤微环境中的重要组成部分,肿瘤相关巨噬细胞可以影响肿瘤的生长、血管生成、免疫调节与转移等。近年来,研究人员逐渐发现M2型肿瘤相关巨噬细胞可以通过多种方式促进肿瘤发生淋巴结转移。然而,截至目前关于M2型肿瘤相关巨噬细胞与淋巴管通透性之间的相互作用鲜有报道,其是否可以在肿瘤免疫微环境中影响淋巴管的通透性值得我们深入研究。研究方法:我们首先针对前期筛选出的可能与淋巴结转移相关的基因CRIP1,在TCGA数据库中比对其在不同肿瘤组织中的表达;随后在本单位生物样本库内的组织样本中分别应用Real-time PCR实验与免疫组化实验,在m RNA及蛋白的水平检测CRIP1在胃癌中的表达水平,并根据临床病理资料分析CRIP1的表达水平与淋巴结转移及生存之间的关系;之后,应用裸鼠构建腘窝淋巴结转移模型判断CRIP1在淋巴结转移中发挥的作用。接下来,我们先借助伊文思蓝染液构建了一个体内淋巴管通透性模型,检测CRIP1对淋巴管通透性的影响;随后应用Luminex实验及ELISA实验探寻可能影响淋巴管通透性的细胞因子,并在体内淋巴管通透性模型中应用中和性抗体加以验证;进一步应用质谱分析、GST pull down实验、PLA实验、Co-IP实验、Ch IP实验以及双荧光素酶报告基因实验并结合生物信息学分析等一系列方法,探寻CRIP1调控该细胞因子的具体机制。最后,我们构建裸鼠皮下成瘤模型并应用免疫荧光实验探究CRIP1对肿瘤微环境中巨噬细胞极化的影响;随后,在体外应用胃癌细胞与THP-1细胞构建共培养体系验证CRIP1对巨噬细胞极化的影响,并应用ELISA实验在共培养体系的培养液上清中检测极化后的巨噬细胞分泌的细胞因子的变化;进一步应用体内淋巴管通透性模型及免疫荧光染色验证肿瘤相关巨噬细胞对淋巴管通透性的影响。结果:应用GEPIA网站分析TCGA数据库显示,CRIP1在多种恶性肿瘤中均呈现显著高表达(p<0.05),biosourced materials且CRIP1的高表达与卵巢癌(p=0.033)、肺癌(p=0.042)及多形性胶质母细胞瘤(p=0.034)的不良预后密切相关。应用Real-time PCR实验在胃癌组织中加以验证,结果显示CRIP1在胃癌组织中呈现高表达且与淋巴结转移相关(p=0.034);胃癌组织芯片的免疫组化结果也显示CRIP1在胃癌组织中呈现高表达(p<0.001),临床病理资料分析显示CRIP1在胃癌中的表达与Borrmann分型(p=0.003)、T分期(p<0.001)、N分期(p<0.001)、TNM分期(p<0.001)以及淋巴结转移(p<0.001)均显著相关,生存分析结果显示CRIP1高表达的病人预后明显差于CRIP1低表达组的病人(p=0.021)。裸鼠腘窝淋巴结转移实验显示,过表达CRIP1可以促进淋巴结转移,使转移淋巴结的比例由40%增加到80%(p=0.025);而敲减CRIP1则抑制淋巴结转移,使转移淋巴结的比例由40%降低到10%(p=0.031)。体内淋巴管通透性模型显示过表达CRIP1可以使转移至腋窝淋巴结的伊文思蓝染液的量显著增加(p<0.001)。随后应用Luminex实验及ELISA实验检测调控淋巴管通透性的关键因子,结果显示稳定过表达CRIP1后细胞培养液上清中CCL5显著增加(p=0.004),而敲减CRIP1则降低CCL5的表达水平(p<0.001);进一步验证显示CCL5的中和性抗体可以显著逆转由过表达CRIP1导致的伊文思蓝染液的增加(p<0.001)。质谱分析、GST pull down、PLA实验以及Western blot实验显示CRIP1可以与PKAα结合促进CREB1的磷酸化从而增强其转录活性。ELISA实验结果显示,过表达CREB1增加CCL5在细胞培养液上清中的表达(p<0.001),而敲减CREB1则会降低其表达(p=0.001),Real-time PCR同样提示CREB1可以调控CCL5的转录。进一步通过Ch IP实验与双荧光素酶报告基因实验证实CREB1可以与CCL5的启动子区结合调控其转录。对成瘤组织的切片进行免疫荧光实验显示,过表达CRIP1可以显著增加M2型肿瘤相关巨噬细胞的浸润(p=0.019),敲减CRIP1则会使其比例降低(p=0.003)。共培养体系的结果显示,过表达CREB1的细胞培养液上清可以诱导THP-1向M2极化(p=0.020),而CCL5的中和性抗体可以逆转这一过程(p=0.022);与此同时,过表达CREB1的细胞培养液上清可以促进巨噬细胞分泌TNF-α(p=0.002),CCL5的中和性抗体同样可以逆转TNF-α的增加(p<0.001)。随后,再次应用淋巴管通透性模型证实TNF-α可以影响淋巴管的通透性(p<0.001)。最后,应用免疫荧光实验发现过表达CREB1组的共培养上清可以使淋巴内皮细胞间的VE-钙黏蛋白表达减少,而加入CCL5的中和性抗体或TNF-α的中和性抗体恢复了淋巴内皮细胞间VE-钙黏蛋白的表达。结论:CRIP1在胃癌组织中高表达,且与胃癌病人的Borrmann分型、T分期、N分期、TNM分期、淋巴结转移以及不良预后密切相关。CRIP1可以增加淋巴管的通透性从而促进淋巴结转移。具体机制为,CRIP1可以与PKAα结合促进CREB1的磷酸化,增强其转录活性,由此促进了CCL5的表达;CCL5促进肿瘤相关巨噬细胞发生M2型极化并分泌TNF-α,降低了淋巴内皮细胞间VE-钙黏蛋白的表达从而增加淋巴管的通透性,促进淋巴结转移。