研究目的:在4例CEBPA双突变AML患者中首次发现了重现性DPF2突变,其突变位点为PHD2结构域上的349位氨基酸由天冬氨酸突变为天冬酰胺(D349N)。本课题拟揭示DPF2突变在CEBPA双突变急性髓系白血病发病中的作用及机制。研究方法:建立D349N突变DPF2(DPF2D349N)及野生型DPF2(DPF2WT)表达载体,用荧光共定位研究突变对DPF在细胞内定位的影响,荧光共定位及免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitation,Co-IP)研究DPF2突变型蛋白与野生型蛋白相互结合的情况。用Co-IP研究突变对DPF2结合乙酰化组蛋白及组装形成SWI/SNF复合物能力的影响。构建表达DPF2WT、DPF2D349N及敲降DPF2白血病细胞系模型,检测DPF2突变对白血病细胞系增殖的影响。用荧光共定位和Co-IP研究DPF2与CEBPA的结合情况。构建DPF2和CEBPA共表达白血病细胞系模型,研究DPF2对表达CEBPA白血病细胞系增殖的影响,在分子和细胞水平阐明DPF2与CEBPA的相互作用。研究结果:通过荧光显微镜观察,我们发现与绿色荧光蛋白(Green Fluorescent Proteins,GFP)融合表达的DPF2wt与Hoechst33342染色的细胞核位置重合,与红色荧光蛋白(Red Fluorescent Proteins,RFP)融合表达的 DPF2D349N也与Hoechst33342染色的细胞核位置重合,提示DPF2WT DPF2D349N均定位于细胞核。同时,我们发现DPF2D349N与DPF2WT荧光位置重合。进一步通过Co-IP证实DPF2WT可结合DPF2D349N。细胞经过组蛋白脱乙酰化酶抑制剂苯丁酸钠处理后,我们通过Co-IP发现野生型DPF2可以与乙酰化组蛋白相结合。与野生型DPF2相比,突变DPF2与乙酰化组蛋白的结合能力下降。SMARCC1是SWI/SNF复合物的重要亚基,通过Co-IP,我们发现DPF2D349N和DPF2WT都可以和SMARCC1相结合,且两者的结合能力没有明显差异。这些结果提示DPF2D349N可以与DPF2WT竞争结合形成SWI/SNF复合物,但DPF2D349N结合乙酰化组蛋白的能力下降,影响SWI/SNF 合物的功能,对DPF2WT具有负显性抑制作用。构建表达DPF2WT或DPF2D349N白血病细胞系模型,我们发现K562细胞中表达DPF2WT组72h 450nmOD值扩增初始的3.27倍,与vector组(3.13倍)相仿(P=0.426),表达DPF2D349N组扩增至初始的3.19倍,也与vector组相仿(P=0.725)。MOLM-13 细胞中,表达 DPF2WT组72h 450nmOD 值扩增至初始的 4.53倍,与vector组(4.88倍)相仿(P=0.077),表达DPF2D349N组扩增至初始的4确认细节.44倍,也与vector组相仿(P=0.083)。以上结果提示表达DPF2WT和DPF2D349N均不影响白血病细胞系增殖。构建DPF2敲降细胞系模型,发现K562细胞中短发夹RNA1敲降DPF2组(简写作DPF2sh1)72h selleck GSKJ4450nmOD值扩增至初始的2。66倍,明显低于scramble shRNA(简写作SCR)组(7.80倍)(P=0.018),短发夹RNA2敲降DPF2组(简写作DPF2sh2)扩增2.10倍,也明显低于SCR组(P=0.019)。MOLM-13细胞中,DPF2sh1组72h 450nmOD值扩增至初始0.74倍,明显低于SCR组(4.88倍)(P<0.001);sh2敲降组扩增0.73倍,也明显低于SCR组(P<0.001)。以上实验提示DPF2敲降减慢细胞增殖。构建DPF2敲降挽救K562细胞模型,发现DPF2WT+DPF2sh1组72h 450nmOD值扩增至初始的4.25倍,明显快于vector+DPF2sh1组(2.56倍)(P=0.002),DPF2D349N+DPF2sh1组扩增至 0.58 倍,明显慢于 vector+DPF2sh1组(P<0.001)。DPF2WT+DPF2sh2组在72h 450nmOD值扩增至初始的3.63倍,明显快于vector+DPF2sh1组(2.58 倍)(P=0.043),DPF2D349N+DPF2sh2 组扩增至 1.07 倍,明显慢于vector+DPF2sh1组(P=0.021)。以上结果提示DPF2WT可部分挽救DPF2敲降表型,DPF2D349N不仅无法挽救,还会进一步减慢细胞增殖。这些结果进一步证实DPF2D3Embryo toxicology49N负显性特征。通过荧光显微镜观察,我们发现与GFP相融合的DPF2和与RFP相融合的CEBPA荧光位置重合,即DPF2与CEBPA荧光定位重合。通过Co-IP发现DPF2WT和DPF2D349N均结合CEBPA。构建DPF2和CEBPA共表达白血病细胞系模型,我们发现,K562细胞中Dox诱导后,CEBPAWT+DPF2WT 72h 450nmOD值扩增至初始的2.32倍,与CEBPAWT+vector组(2.24倍)相仿(P=0.436),CEBPAWT+DPF2D349N组扩增至1.15倍,明显慢于 CEBPAWT+vector 组(P=0.006)。当 CEBPA 为突变型(CEBPAV314VW)时,CEBPAV314VW+DPF2WT组在72h 450nmOD值扩增至初始的3.92倍,与CEBPAV314VW+vector组(4.14倍)相仿(P=0.493),CEBPAV314VW+DPF2D349N组扩增至 2.64 倍,明显慢于 CEBPAV314VW+vector 组(P=0.002)。MOLM-13 细胞中Dox诱导后,CEBPAV314VW+DPF2wt组在72h 450nmOD值扩增至初始的4.25倍,与CEBPAV314VW+vectctor组(4.15倍)相仿(P=0.649),CEBPAV314VW+DPF2D349N组扩增至1.30倍,明显慢于CEBPAV314VW+vector组(P<0.001)。以上结果表明,表达DPF2D349N会减慢表达CEBPA的白血病细胞系的增殖,提示DPF2与CEBPA存在相互作用。研究结论:DPF2D349N为负显性突变,DPF2与CEBPA间存在相互作用,突变的DPF2通过其负显性作用可能参与了 CEBPA突变白血病的发生发展。研究目的:研究高三尖杉酯碱(homoharringonine,HHT)对CEBPA蛋白的影响及其机制,探讨HHT治疗CEBPA双突变急性髓系白血病的作用机制。研究方法:构建K562 CEBPA p30表达细胞系,用Wetern Blot法测定HHT、柔红霉素(DNR)、阿糖胞苷(Ara-C)处理前后K562 CEBPA p30表达细胞系以及U937、MOLM-13细胞系中外源和内源性CEBPA蛋白的表达量的变化,测定蛋白酶抑制剂和蛋白合成抑制剂对CEBPA蛋白表达量的影响。用转录组RNA-seq分析与柔红霉素处理相比,HHT处理后基因表达和通路富集的差异。研究结果:无论是U937和MOLM-13细胞系中的内源性CEBPA蛋白还是K562 CEBPA p30表达细胞系中的外源性CEBPA蛋白,HHT均可降低其表达量(P<0.05),而DNR和Ara-C无此效果。蛋白酶体抑制剂可增加CEBPA蛋白的表达量(P<0.05),蛋白合成抑制剂可减少CEBPA蛋白的表达量(P<0.05)。HHT处理上调了K562 CEBPAp30细胞的核糖体生成相关通路,DNR则不具有这种作用。研究结论:HHT可抑制CEBPA的合成,降低CEBPA蛋白的表达水平,这可能是HHT治疗CEBPA双突变AML的作用机制。