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目的 研究虫草素通过调控miR-135b-5p表达对宫颈癌Hela细胞侵袭、转移的影响及其调控机制。方法 用浓度为50μmol/L(虫草素Ⅰ组)和100μmol/L(虫草素Ⅱ组)的虫草素处理宫颈癌Hela细胞，另设空白对照组，用MTT法测定Hela细胞的生长情况。采用Transwell法测定Hela细胞侵袭情况，采用划痕实验检测宫颈癌Hela细胞的转移能力，采用Real-time PCR法测定人永生化表皮细胞Hacat和宫颈癌Hela细胞中miR-135-5p的表达水平及不同浓度虫草素处理后对miR-135-5p的表达水平的影响。转染miR-135b-5p mimic至宫颈癌Hela细胞，Medical hydrology并采用Transwell技术和划痕实验检测宫颈癌Hela细胞的侵袭能力和转移能力。结果 加入虫草素后宫颈癌Hela细胞生长受到显著的抑制，且高浓度的虫草素抑制作用更明显(P<0.05)。宫颈癌Hela细胞中miR-135b-5p的表达水平为(1.97±0.07),显著高于人永生化表皮细胞Hacat细胞中miR-135b-5p的表达水平(1.01±0.03),组间比较差异具有统计学意义(t=28.187,P=0.000)。加入虫草素www.selleck.cn/products/Decitabine后，宫颈癌Hela细胞侵袭率和转移率及miR-135b-5p表达明显降低；且高浓度虫草素处理后，宫颈癌Hela细胞侵袭率IDN-6556和转移率更低，组间比较差异均具有统计学意义(t=138.614～317.100,P<0.05)。过表达miR-135b-5p显著增加宫颈癌Hela细胞的侵袭率和转移率(t=7.145,t=7.465,P<0.05),且Vimentin表达增加、E-cad表达降低(t=8.223,t=7.473,P<0.05)。结论 虫草素可通过抑制miR-135b-5p表达进而抑制Hela细胞的侵袭和转移。

靶向AKT1抗癌药物的研发在多种癌症中被报道，但中药复方靶向AKT1的相关研究较少。本研究探讨了一种治疗胃病中药配方——复方胃痛selleck化学胶囊，通过靶向AKT1在体内外发挥抗前列腺癌生长的作用。通过质谱、靶点预测及生物信息学分析发现，复方胃痛胶囊主要成分中有37种化合物成分具有抗癌活性，木兰花碱[(+)-Magnoflorine]、7-羟基香豆素(7-hydroxycoumarin)等6种成分可能是其抗前列腺癌的主要活性成分。MTT、ROS、细胞凋亡及细胞周期结果显示，复方胃痛胶囊对前列腺癌细胞具有显著的体外抑制作用(P<0.01),80μg/mL浓度下PC3细胞生长抑制率达35%左右，上调ROS产生，并显著促进细胞凋亡(P<0.01)及G_2/M期阻滞(P<0.01)。体内研究结果Canagliflozin分子式证实，该药物对皮下前列腺癌肿瘤形成有显著抑制作用(P<0.01)。PPI网络互作、生物信息学分析显示，AKT1、CCND1、ERS1、EGFR等靶medical decision点可能发挥核心作用。分子对接及细胞热稳定性结果证实，磷酸化的AKT是复方胃痛胶囊的作用靶点之一(P<0.01),且复方胃痛胶囊显著抑制pAKT(Ser473)表达。本研究证实，复方胃痛胶囊能在体内外抗前列腺癌生长，且可能通过靶向抑制pAKT(Ser473)发挥作用，并探讨了中药复方靶向AKT1治疗前列腺癌的可能性。

目的 分析常规西药联合养血清脑颗粒在脑动脉硬化症患者中的应用效果。方法 取2020年4月—2021年4月收治的82例脑动脉硬化症患者，按照随机数字表法将其分为观察组和对照组，各41例。其中对照组接受常规西药治疗，观察组在对照组基础上联合养血清脑颗粒治PLX-4720临床试验疗，两组均连续治疗1个月。将两组的血脂水平、凝血状态、血清学指标、中医症状有效率进行对比。结果 治疗后，与对照组相比，观察组的总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)水平明显低，高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)水平明显升高(P<0.05Pexidartinib浓度);与对照组相比，观察组的血小板聚集率treatment medical(PAR)、血液黏度(CP)、纤维蛋白(FIB)水平明显降低(P<0.05);相比于对照组，观察组的血管紧张素酶Ⅱ(Ang-Ⅱ)水平明显降低(P<0.05);观察组的中医症状有效率(95.02%,39/41)较对照组(78.05%,32/41)高(P<0.05)。结论 给予脑动脉硬化症患者常规西药联合养血清脑颗粒治疗，明显改善了其血脂指标、血流动力学指标，辅助提高了预后效果。

目的 探讨影响弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBLC)患者预后相关因素。方法 回顾性分析2017年1月至2019年3月河南省直第三人民医院收治的114例DLBCL患者临床资料。采用Kaplan-Meier生存分析法分析DLBLC患者的3年总生存率；单因素Kaplan-Meier生存分析法比较不同临床特征的DLBLC患者3年总生存率，将差异有统计学意义的因素纳入Cox比例风险回medication-induced pancreatitis归模型，分析DLBLC患者预后的影响因素。结果 全组中位随访时间39(4～62)个月，Kaplan-Meier生存分析显示全组3年总生存率为49.2%，中位生存时间为34.6个月。单因素Kaplan-Meier生存分析显示，年龄、临床分期、有无B症状者、乳酸脱氢酶、IPI评分、是否使用利妥昔单抗及miR-27a表达水平均与DLBLC患者3年生存率，差异有统计学意义(P <0.05)。Cox多因素获悉更多分析显示，年龄> 60岁(HR=1.288)、临床分期为Ⅲ+Ⅳ(HR=2.362)、有B症状(HR=1.246)、乳酸脱氢酶增高(HR=1.427)、IPI评分> 2分(HR=1.514)是DLBCL患者预后的独立危险因素，而miRBlebbistatin体外-27a高表达(HR=0.523)是保护因素，差异有统计学意义(P <0.05)。结论 年龄、临床分期、B症状、乳酸脱氢酶、IPI评分及miR-27a表达均与DLBLC患者预后有关，其中miR-27a高表达为患者预后的保护因素。

目的 观察富马酸亚铁多库酯钠胶囊联合生血宁片对妊娠期合并缺Gefitinib-based PROTAC 3体内铁性贫血(IDA)患者铁代谢参数、母婴结局的影响。方法 以随机数表法将2019年3月至2021年3月铜川市人民医院妇产科收治的102例妊娠期合并IDA患者分为联合组和对照组各56例。对照组患者给予富马酸亚铁多库酯钠胶囊治疗，联合组患者使用富马酸亚铁多库酯钠胶囊联合生血宁片治疗，两组患者均治疗4周。治疗4周后，比较两组患者的临床疗效，以及治疗前后的血清学指标[血红蛋白(Hb)、红细胞(RBC)、平均红细胞(MCH)]、铁代谢参数[铁蛋白(SF)、铁(SI)、转铁蛋白饱和度(TSAT)]水平，并比较两组母婴结局及不良反应发生情况。结果 联合组患者的临床治疗总有效率为98.21%，明显高于对照组的87.50%，差异有统计学意义(P<0.05)；治疗前，两组患者的血清学指标、铁代谢参数比较差异均无统计LXH254学意义(P<0.05)；治疗4周后，联合组患者的血清学指标和铁代谢参数明显高于对照组，差异均有统计学意义(P<0.05)；联合组患者的不良妊娠结局总发生率为3.58%，明显graft infection低于对照组的14.29%，差异有统计学意义(P<0.05)；联合组患者的便秘发生率为3.58%，明显低于对照组的14.29%，差异有统计学意义(P<0.05)，而两组患者的恶心呕吐、牙龈黑染、皮疹发生率比较差异均无统计学意义(P>0.05)。结论 富马酸亚铁多库酯钠胶囊联合生血宁片能有效改善妊娠期IDA患者贫血相关血清指标及铁代谢参数，减少不良妊娠结局的发生，且不增加用药不良反应。

背景和目的:卵巢癌细胞易于从原发部位脱落,经腹腔种植和淋巴/血行转移,在肠道、大网膜等部位形成难以手术清除的转移灶。上皮-间充质转化(EMT)是参与启动肿瘤细胞转移的主要机制,涉及广泛的表型和分子变化。锌指蛋白SNAI1(亦称Snail,基因名为SNAI1),可调控包括上皮标志物E-cadherin/CDH1等多种基因的表达,是癌症中诱导EMT的关键因子。Snail高度不稳定,可被蛋白酶体快速降解。SQSTM1(sequestosome 1或p62)是连接泛素化和自噬的接头蛋白,近年来,p62被报道在多种疾病模型(胶质母细胞瘤、膀胱肿瘤、心肌纤维化)中,与Snail蛋白的泛素化和降解相关。然而,在卵巢癌细胞中p62是否影响Snail的泛素化和表达水平尚不清楚。泛素化是一种翻译后修饰,参与细胞内大多数蛋白的降解机制,包括SnaiSB203580说明书l和重要的内源性抗氧化分子NRF2。泛素化修饰由泛素激活酶(E1)、泛素结合酶(E2)和泛素连接酶(E3)组成的酶促级联反应完成。E2的功能包括,识别、结合泛素/类泛素(Ub/Ubl)分子并将其传递给E3连接酶和底物,协助决定Ub/Ubl链类型和识别底物特异性,从而参与调控细胞内多种生命活动。本研究通过生物信息学,筛选并分析泛素化通路中与卵巢癌密切相关的基因和酶。结果发现,泛素结合酶E2E2(Ubiquitin Conjugating Enzyme E2E2,UBE2E2)在卵巢癌中高表达,且与临床不良预后相关。UBE2E2(也称为Ubc H8)于1997年被首次报道,随后被证实在多种人类疾病中发挥致病作用,包括2型糖尿病(T2D)、风湿免疫性疾病、帕金森病、非小细胞肺癌和肝癌。此外,UBE2E2与脂肪生成和RR间期相关。然而以上多数研究证据是基于全基因组关联研究(GWAS)和Meta分析,关于UBE2E2的生物学功能仍不明确,尤其有关UBE2E2与卵巢癌的关系国内外未见研究报道。因此,本文后续以卵巢癌A2780、SKOV3细胞和临床卵巢癌组织样本为研究对象,探索UBE2E2在卵巢癌恶性进展和转移中的作用及相关分子机制,对于进一步阐明卵巢癌的致病因素并以此为靶点寻找治疗方法具有参考意义,也希望为发展肿瘤标志物和预后指标提供新的思路。方法:(1)生物信息学:运用在线数据库GEPIA、Oncomine、The Human Protein Atlas、KEGG、KM Plotter分别进行基因表达水平、信号通路分析和生存分析,Schr?dinger program软件进行UBE2E2蛋白质结构模拟。(2)细胞实验:运用CRISPR-Cas9系统构建稳定敲除UBE2E2的A2780细胞系。转染si RNA/质粒载体实现基因敲低/过表达。细胞计数、克隆形成、划痕、Transwell实验检测细胞增殖和迁移能力。q RT-PCR、Western blot、IP实验检测基因的m RNA、蛋白表达水平、Snail蛋白泛素化水平。co-IP检测蛋白间的相互作用。构建不同的UBE2E2突变体和截短体。细胞免疫荧光和核质分离实验检测蛋白在不同细胞组分中的定位和表达情况。(3)动物体内实验:通过手术、腹腔注射,在小鼠体内建立异种卵巢癌原位种植模型、卵巢癌腹腔种植模型。利用小动物活体成像系统对肿瘤进行荧光成像,并进行Western blot和免疫组化检测。(4)临床样本:收集88例卵巢癌和26例正常卵巢Xenobiotic metabolism组织样本,Western blot和免疫组化检测蛋白表达水平。统计卵巢癌患者的临床资料和预后信息进行生存分析。结果:(1)分析TCGA、GTEx和The Human Protein Atlas数据库的结果,以及本研究收集的临床样本检测结果均显示,与正常卵巢组织相比,UBE2E2的m RNA和蛋白表达水平在卵巢癌中升高,DNA水平无显著差异。Kaplan-Meier Plotter数据库和临床样本的生存分析结果均提示,UBE2E2的高表达与临床上卵巢癌患者的不良预后相关。(2)在体外实验中,UBE2E2的沉默会抑制卵巢癌细胞的增殖、迁移能力,使EMT诱导因子Snail、Slug和间质标志物N-cadherin等蛋白表达水平下降,上皮标志物E-cadherin表达增多;而UBE2E2的过表达具有相反作用。(3)UBE2E2的过表达/敲低能够提高/降低卵巢癌细胞中p62的m RNA表达水平,促进/抑制p62蛋白在胞质内的积累,但不显著影响细胞内自噬标志物LC3B蛋白的水平和自噬体的形成。过表达p62可以提高卵巢癌细胞内Snail蛋白的水平,但是co-I此网站P实验没有检测到UBE2E2、p62、Snail蛋白之间的相互作用。UBE2E2的过表达通过降低Snail蛋白的泛素化修饰水平来抑制其降解,进而增强Snail介导的EMT。(4)UBE2E2的过表达/沉默能够分别上调/下调NRF2及其靶基因(抗氧化基因HO-1、GCLC、GCLM和解毒基因NQO1)的表达水平。抗氧化剂t BHQ可明显激活NRF2的表达并诱发其核易位,但这些作用在敲除UBE2E2的细胞中均被显著抑制了。此外,UBE2E2不影响NRF2的m RNA水平。(5)UBE2E2蛋白的UBC结构域(缺失1-52位氨基酸的突变体/截短体Δ1-52)单独表达时,即具有进入细胞核内的功能。与完整的野生型/WT-UBE2E2蛋白相比,活性位点半胱氨酸(Cys139)发生失活突变的C139A-UBE2E2突变体进入细胞核内的功能受阻,对p62和Snail介导的EMT通路的激活作用也受到抑制。(6)WT-UBE2E2、C139A-UBE2E2突变体、UBE2E2蛋白的N端延伸(缺失53-201位氨基酸的突变体/截短体Δ53-201)都具有激活卵巢癌细胞内NRF2通路的作用。Co-IP实验结果显示WT-UBE2E2、C139A-UBE2E2突变体、Δ53-201截短体都能够在卵巢癌细胞内与NRF2蛋白发生相互作用。在敲除UBE2E2的A2780细胞中重新过表达的WT-UBE2E2、C139A-UBE2E2突变体与NRF2蛋白主要共定位于细胞质内。(7)在卵巢癌原位种植模型和腹腔种植模型中,与接种对照组A2780细胞的小鼠相比,接种敲除UBE2E2-A2780细胞组的小鼠体内形成的肿瘤总体积明显更小,平均荧光总辐射度值更弱。小鼠平均体重在组间没有显著差异。与对照组相比,敲除UBE2E2-A2780细胞组小鼠体内形成的肿瘤中,UBE2E2几乎不表达,p62和Snail蛋白表达减少,E-cadherin蛋白的表达增多。结论:(1)UBE2E2在体内、外促进卵巢癌细胞增殖、EMT和转移。(2)UBE2E2通过增强卵巢癌细胞中p62水平,抑制Snail蛋白的泛素化降解而稳定其表达,最终促进Snail相关的EMT,但对细胞自噬无明显影响。(3)UBE2E2通过其N端延伸与NRF2相互作用,UBE2E2全长蛋白激活卵巢癌细胞中NRF2-ARE抗氧化应激系统。(4)UBE2E2的活性位点半胱氨酸(Cys139)发生突变会破坏UBE2E2在卵巢癌细胞内的分布和功能。

目的：探讨实脾消积方（SPXJF）对糖代谢异常下肝癌细胞体外模型铁死亡的作用及机制。方法：使用高胰岛素干预HepG2细胞建立糖代谢异常肝癌细胞模型，并采用葡萄糖氧化酶法检测葡萄糖含量和CCK-8法检测抑制率验证模型是否成功；设立对照组、模型组、二甲双胍组和SPXJF低、中、高剂量组，检测各组葡萄糖消耗量、细胞活力和细胞增殖、迁移、侵袭能力；检测细胞谷胱甘肽（GSH）、活性氧簇（ROselleck化学S）及丙二醛（MDA）水平以评估脂质过氧化hepatoma-derived growth factor水平；Western blot法检测铁死亡相关蛋白P53、溶质载体家JNJ-42756493研究购买族7成员11(SLC7A11/xCT)和谷胱甘肽过氧化物酶4(GPX4)的表达。结果：与对照组相比，糖代谢异常肝癌细胞葡萄糖消耗量显著降低（P<0.05），细胞活力和增殖能力无显著差异（P>0.05），但迁移和侵袭能力显著提高（P<0.05），而二甲双胍及SPXJF能明显抑制糖代谢异常下肝癌细胞活力以及增殖、迁移和侵袭能力（P<0.05）；模型组GSH水平高于其他组，而ROS和MDA水平低于其他组，此外，模型组P53表达下调，xCT和GPX4表达下调，而加入SPXJF及二甲双胍处理后上述指标表达逆转（P<0.05）。结论：SPXJF能通过P53/xCT/GPX4通路诱导糖代谢异常下肝癌细胞铁死亡。

阿克拉维酮(aklavinone)是合成蒽环抗癌药的中间体,具有极高的经济价值。由于其在原生产菌(Streptomyces galilaeus,S.peucetius)中难以高产,故选择适宜的宿主进行异源生物合成阿克拉维酮是可行路线。在诸多宿主中,大肠杆菌(Escherichia coli)由Dorsomorphin采购于其生长快速,产物易分离、基因操作手段丰富而成为异源表达宿主的首选。阿克拉维酮是II型聚酮合酶(polyketide synthase,PKS)催化的产物,该类酶在大肠杆菌中通常以包涵体形式存在,因此在大肠杆菌中重构PKS系统具有挑战性。探究阿克拉维酮合成途径中关键酶基因的异源可溶性表达,可为在大肠杆菌中重构阿克拉维酮,甚至阿霉素和阿克拉霉素途径奠定基础。本文围绕生物合成阿克拉维酮的关键酶基因dpsA、dpsB、dpsC、dpsD以及dpsG的异源可溶性表达,进行了以下探究:1.通过降低表达温度、降低诱导剂浓度、更换表达菌株、引入分子伴侣蛋白、更换启动子等手段,尝试提高蛋白质Dps A、Dps B、Dps C和Dps D的溶解度。结果表明,温度、诱导剂浓度以及表达菌株不是蛋白质形成包涵体的主要原因;2.为寻找DpsG的修饰蛋白,使DpsG在大肠杆菌具有催化活性,串联表达dpsG以及holo-ACP合成酶基因acp S,通过蛋白纯化及SDS-PAGE分析可知,Acp S成功将DpsG激活;3.为研究基因偶联、蛋白融合以及基因串联表达对蛋白可溶性的影响,对dpsB和dpsC的表达载体重新设计,使其以4个核苷酸重叠的方式进行排列,让基因偶联转录;以柔性Linker连接dpsB和dpsC基因,使蛋白质融合;另外将dpsB、dpsC、dpsG和acp S进行串联表达,以保证ACP-KS-CLF复合体的完整性。结果显示,偶联转录和融合表达对Dps B和Dps C的可溶性表达无影响,min PKS的蛋白之间不存在互相促进折叠的关系;4Dynamic medical graph.基于Solubis和AGGRESCAN3D(A3D)对Dps A、Dps B、Dps C和Dps D进行蛋白质点突变设计,基于PROSS蛋白设计在线服务器对Dps C进行多位点突变,试图通过改造蛋白聚集区域提高蛋白质溶解度。其中由Solubis和A3D筛选出的突变位点并未明显提高蛋白质可溶性;而采用PROSS对Dps C的重新设计则极大提高了Dps C的溶解度。本文探究了降低蛋白质表达量、共表达分子伴侣BMS-354825使用方法、基因表达方式重新设计对蛋白质表达的影响;在上述实验的基础上,通过设计蛋白质点突变提高蛋白质溶解度,设计成功筛选出极具潜力的Dps C可溶性突变体,其在大肠杆菌内溶解度大大提升,这为阿克拉维酮合成途径在大肠杆菌中重构奠定了基础,也为其余II型聚酮合酶在大肠杆菌中的表达提供了方法。

目的:探究人脐带间充质干细胞来源外泌体(huc MSC-EXOs)对肾缺血再灌注损伤(IRI)的保护作用,明确瞬时受体电位阳离子通道6(TRPC6)/聚腺苷二磷酸核糖聚合酶1(PARP1)信号通路在该过程中的重要作用及其调控机制。方法:(1)选取生长良好的3～8代huc MSCs,用DMEM/F12完全培养基(含10%胎牛血清+1%青链霉素)进行培养。待细胞融合度达80%～90%时,更换无血清培养基培养,培养24～48 h后收集细胞上清液,将其置于离心管中,使用超速离心法进行梯度离心提取外泌体,所获得的外泌体经过透射电镜(TEM)、纳米颗粒追踪分析(NTA)、蛋白质印记法(Western blot)检测,完成huc MSC-EXOs鉴定。(2)SPF级健康雄性SD大Sulfamerazine antibiotic鼠30只,体质量220 g～250 g,随机数字表法分为5组,假手术组(S组)、假手术+TRPC6抑制剂SKF96365组(SS组)、肾缺血再灌注组(IRI组)、肾缺血再灌注+外泌体组(EXO组)、外泌体+TRPC6抑制剂SKF96365组(ES组),每组6只。采用夹闭双侧肾蒂45 min,再灌注24 h的方法构建雄性大鼠肾IRI模型。EXO组和ES组在夹闭双侧肾蒂前15 min将20μg外泌体溶液随机注射到左肾的5个部位,其余各组注射等容量PBS;ES组夹闭肾蒂前5 min尾静脉注射TRPC6抑制剂SKF96365 1.5 mg/kg,SS组游离双侧肾蒂前5 min尾静脉注射等量SKF96365。再灌注24 h后处死大鼠,收集大鼠血清、肾组织标本,HE染色后通过光学显微镜观察肾组织病理学改变并进行Paller评分,通过检测血清肌酐(Cr)、血尿素氮(BUN)评价肾功能改变,Western blot检测各组大鼠肾组织坏死性凋亡标志分子受体相互作用蛋白激酶(RIPK)1、RIPK3和混合谱系激酶结构域样蛋白(MLKL)及TRPC6、PARP1的表达水平。结果:(1)外泌体鉴定:TEM观察到所提取huc MSC-EXOs为具有双层质膜的小囊泡,呈茶托型或一侧凹陷的半球形样形态;NTA结果证实提取的外泌体粒径大小范围为30～150nm;Western blot检测外泌体表面标志蛋白CD9、CD63及CD81表达阳性,符合外泌体特征。(2)与S组比较,SS组未见肾组织损伤,Paller评分、Cr和BUN水平正常(selleckP>0.05),IRI组可见明显肾组织损伤,Paller评分、Cr和BUN水平升高,RIPK1、RIPK3、MLKL表达增加,TRPC6、PARP1表达下降(P<0.05);与IRI组比较,EXO组Paller评分、Cr和BUN水平降低,RIPK1、RRoxadustat分子式IPK3、MLKL表达下降,TRPC6、PARP1表达增加(P<0.05);与EXO组比较,ES组Paller评分、Cr和BUN水平升高,RIPK1、RIPK3、MLKL表达增加,TRPC6、PARP1表达下降(P<0.05)。结论:huc MSC-EXOs可减轻大鼠肾IRI所致的坏死性凋亡,其保护机制与TRPC6/PARP1通路激活有关。

研究表明皮肤组织中也存在着局部肾素-血管紧张素系统(RAS),参与到伤口愈合、炎症、银屑病、衰老等多种皮肤生理和病理活动调控中。血管紧张素转化酶(ACE)在RAS的调控中发挥核心作用,部分ACE抑制剂也被发现能够改善瘢痕、皮肤光老化等问题,但是这类药物合成的ACE抑制剂存在着较为严重的副反应。因此从食源蛋白质中开发天然ACE抑制肽,为ACE的抑制剂的应用提供了新的方向。本课题以螺旋藻蛋白为原料,通过蛋白酶水解制备螺旋藻ACE抑制肽,结合肽组学和计算模拟的方法,从中筛选具有ACE抑制活性的活性肽。以L929细胞为模型结合蛋白组学探究其生物活性。同时对所获得的ACE抑制肽的安全性与稳定性进行评价。具体的研究内容如下:(1VX-445)依据水解度、ACE抑制率以及DPPH清除率,从碱性蛋白酶、中性蛋白酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶四种不同来源的蛋白酶中筛选最佳的螺旋藻蛋白水解酶制备ACE抑制肽,结果表明碱性蛋白水解酶产物具有最高的水解度、ACE抑制率和DPPH清除率。LC-MS/MS并结合数据库对螺旋藻碱性蛋白酶水解液肽段进行分析,共鉴定出782条肽段。采用药效团模型和分子对接对进行分析,筛选出两种新型ACE抑制肽HIIARPH和LRLKE,IC_(50)分别为461.5μmol/L和155.8μmol/L。Lineweaver-Burk双倒数作图法表明HIIAntipseudomonal antibioticsARPH和LRLKE的抑制类型皆为非竞争性抑制。(2)通过Western Blot确定Ha Ca T、NIH 3T3、L929细胞都能表达ACE,皮肤成纤维细胞L929表达量最高并被选为研究对象。采用MTT法对HIIARPH和LRLKE细胞毒性进行检测,在1.0 mmol/L浓度下,两种抑制肽对L929细胞无明显毒性。通过LPS刺激L929细胞建立炎性衰老模型,并采用RT-PCR对ACE和AT_1R的m RNA表达进行检测,采用Western Blot对ACE和Ang II的蛋白表达进行检测、采用ELISA对培养上清中的Ang II进行检测。结果表明LPS能够激活RAS,增加ACE/Ang II/AT_1R通路的m RNA和蛋白表达并确定LPS刺激细胞浓度为1.0μg/m L。分别用不同浓度HIIARPH、LRLKE的处理LPS刺激的L929细胞,并对细胞内SOD和CAT酶活性进行检测。结果表明HIIARPH和LRLKE都能提高抗氧化酶SOD和CAT的酶活性,且LRLKE的抗氧化能力优于HIIARPH。采用ELISA检测细胞衰老相关分泌表型(SASP)IL-6的分泌情况,发现HIIARPH和LRLKE能减少IL-6的分泌。采用1.0 mmol/L的HIIARPH和LRLKE分别处理细胞研究其对RAS的影响,并采用ELISA对培养上清中的ACE活性进行检测,采用RT-PCR对ACE、AT_1R以及AT_2R的m RNA表达进行检测,采用Western Blot对ACE和AT_1R的蛋白表达进行检测。结果表明,HIIARPH和LRLKE都能抑制胞外ACE的活性,抑制RAS中ACE/Ang II/AT_1R通路,而LRLKE能进一步激活AT_2R。(3)通过蛋白质组学进一步分析了LRLKE在LPS诱导的L929细胞中参与调控的蛋白差异表达情况。研究结果验证了LRLKE参与调控了L929多种信号通路如细胞衰老、p53、NF-κB、病毒感染、铁死亡、自噬等。同时根据蛋白富集分析等结果,通过Western Blot和ELISA对细胞衰老、细胞凋亡信号通路中的差异蛋白进行验证。实验证明蛋白组学数据可靠具点击此处有可参考价值,LRLKE通过ACE/AT_1R/NF-κB/IL-6通路参与调控细胞炎性衰老,ACE/AT_1R/Bcl-2/Bax或者ACE/AT_1R/Bid/Bax调控细胞凋亡过程。(4)对1.0 mmol/L的HIIARPH和LRLKE分别进行安全性测试。采用直接多肽反应(DPRA)对两种ACE抑制肽的致敏性进行测试;采用鸡胚绒毛尿囊膜实验(HET-CAM)和小鼠红细胞溶血对两种ACE抑制肽的刺激性进行测试;采用艾姆斯(Ames)实验对两种ACE抑制肽的致突变性进行测试;采用人体斑贴实验进行人体安全性测试。结果表明1.0 mmol/L浓度下的HIIARPH和LRLKE无刺激性、致敏性以及致突变性,对人体安全。(5)对HIIARPH和LRLKE的温度、p H以及存储稳定性进行测试,结果表明,LRLKE具有较好ACE抑制活性稳定性,温度以及p H的变化对其影响较小。而HIIARPH在温度>50℃以及p H<6时,活性显著降低。此外0℃和25℃条件下储存16天,对两种ACE抑制肽的抑制活性无显著影响。