Author: admin

目的 通过网络药理学和实验验证方法探讨雷公藤治疗黑色素瘤的活性成分、作用靶点及信号通路，分析雷公藤对黑色素瘤的作用机制。方法 通过TCMSP数据库检索雷公藤的有效成分及靶点，借助GeneCards、biological half-lifeOMIM数据库获取中药与疾病的交集靶点。采用Cytoscape 3.7.1进行拓扑分析，构建“药物活性成分–疾病靶点”网络图。运用String平台构建共同靶点蛋白相互作用（PPI）网络和条形图，筛选出核心靶点。进行靶点基因富集分析，完成核心靶标与成分的分子对接。利用CCK-8及q PCR方法验证核心单体成分对黑色素瘤及治疗靶点的作用。结果 雷公藤有效成分51个，其中最优成分是雷公藤甲素、山柰酚。雷公藤甲素对黑色素瘤细胞具有明显抑制作用，且显著降低核心治疗靶点蛋白激酶B1(Akt1)、血管内皮生长因子A(VEGFA)的mRNA表达（P<0.01、0.001）。结论 雷公VP-16临床试验藤治疗黑色素瘤具有多靶点NVP-TNKS656作用、多通路的特点，其中雷公藤甲素是其核心药用成分，该研究为雷公藤抗黑色素瘤提供了实验依据。

色氨酸羟化酶(Twww.selleck.cn/products/plx5622PH)可催化色氨酸羟化为5-羟基色氨酸(5-HTP),是5-HTP生物合成过程中的关键酶.为了提高大肠埃希氏菌细胞工厂合成5-HTP的效率,通过酶的理性设计和定点突变技术构建了人色氨酸羟化酶-2(TPH2)的系列突变体,并在高产L-色氨酸且含有TPH辅酶四氢生物蝶呤(BH4)合成与再生模块的大肠埃希氏菌中表达.发现适当降低酶和色氨酸、酶和BH4间结合的氢键数目有助于提高5-HTP产量;酶和底物色氨酸结合情况不变,辅酶BH4与酶间氢键数目越多5-HTP产量越低。5-HTP产量最高的NSC125066 molecular weight细胞工厂是由突变酶V195A/V197Isurgical pathology构建的,5-HTP产量较野生酶构建的细胞工厂产量提高54%,1 L补料摇床发酵48 h 5-HTP产量达16.17 g/L。理性设计是提高TPH2酶活,突破5-HTP合成限速步骤的有效途径, TPH2和底物色氨酸、辅酶BH4间氢键连接太多或太少都不利于其催化活性的发挥。

目的 利用美国FLorlatinib说明书DA不良事件报告系统(FAERS)数据库，挖掘孟鲁司特精神病学不良事件(PAEs)信号，为临床合理用药提供参考。方法 检索FAERS数据库中孟鲁司特相关PAEs报告，检索时间为该药批准上市至2022年第1季度。采用报告比值比法(ROR)和综合标准法(MHRA)对PAEs进行信号挖掘。结果 经数据清洗后，共筛选出孟鲁司特相关PAEs报告9 234份，男女比例约Medicaid prescription spending为1∶1。患者年龄以4～12岁为主，占比为31.11%;上报人员以消费者为主(48.77%),上报国家以美国为主(35.27%),患者结局以住院为主(12.22%)。经MHRA法和ROR法双重筛选，共获得PAEs信号103个。发生频次前3名为说明书记载PAEs,分别为焦虑、自杀意念和攻击性行为。ADE信号强度前3位为新发PAEs,分别为神经精神症状、分离焦虑症和儿童人格障碍。结论 本Pidnarulex研究购买次基于FAERS数据库的孟鲁司特PAEs信号挖掘研究，可为孟鲁司特的合理使用提供参考依据。

目的：探究N-乙酰化脯氨酸-甘氨酸-脯氨酸（N-acetylated proline-glycine-proline, N-Ac-PGP）通过Toll样受体4(Toll-like receptor 4, TLR4)诱导巨噬细胞M1极化对慢性阻塞性肺疾病（chronic obstructive pulmonary disease, COPD）炎症反应的影响。方法：检测COPD患者痰液中N-Ac-PGP和M1型巨噬细胞炎性细胞因子的表达。体外培养人单核细胞白血病细胞THP-1，使用佛波脂（phorbol 12-myristate 13-acetate, PMA）诱导使之分化为M0型巨噬细胞，然后使用脂VX-765纯度多糖（lipopolysaccharide, LPS）和N-Ac-PGP诱导M0型巨噬细胞极化为M1型。采用RTqPCR和Western blot法分别检测巨噬细胞表面标志物CD11b、CD45、CD86和诱导型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase, iNOS）的mRNA和蛋白表达水平。使用ELISA检测M1型巨噬细胞炎性细胞因子肿瘤坏死因子α(tu-mor necrosis factor-α, TNF-α)、白细胞介素1β(interleukiLGX818体内n-1β, IL-1β)、IL-6和IL-23的水平。最后抑制TLR4通路，再次检测巨噬细胞的极化情况。结果：N-Ac-PGP与M1型巨噬细胞炎性细胞因子表达量呈显著正相关。PMA处理THP-1细胞成功诱导分化为M0型巨噬细胞。LPS和N-Ac-PGP处理后M1型巨噬细胞的标志蛋白表达显著增加（P<0.05），证明经过LPS和N-Ac-PGP处理的M0型巨噬细胞向M1型极化。同时，炎性细胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-23的表达上调（P<0.05）。进一步的实验中，TLR4抑制剂与N-Ac-PGP联用逆转了N-Ac-PGP对M0型巨噬细胞向M1型极化的促进作用，也显著降低Starch biosynthesis了炎性细胞因子的表达水平（P<0.05）。结论：N-Ac-PGP通过激活TLR4诱导的巨噬细胞M1极化促进COPD炎症反应。

背景抗生素耐药性正在成为一个“全球公共卫生问题”。抗生素耐药性出现的主要原因除了抗生素的误用和滥用问题,更重要的是新抗生素的发现和开发明显滞后于细菌耐药性产生的速度。因此,大多数国际组织为鼓励学术界和制药行业对抗生素的研发都制定了适当的政策,开发新型抗菌剂以对抗多药耐药细菌已成为亟待解决的优先事项。“膜破坏”被认为是大多数抗菌肽发挥抗菌作用的主要机制,这些抗菌肽具有独特的克服或减少细菌耐药性发生的能力。近年来,阳离子抗菌肽(cationic antimicrobial peptides,CAMPs)因其快速的杀伤动力学、广谱的抗菌活性、低耐药率和独特的作用模式而被广泛认为是抗生素最有前途的替代品之一。与天然抗菌肽相比,小分子模拟肽除具有上述特性外还具有许多显著的优势,包括灵活的化学修饰框架、降低的毒性、增强的抗菌活性、更高的体外和体内稳定性,以及更好的药代动力学特性等。利用模拟抗菌肽结构和功能的策略开发新型抗耐药菌的膜靶向小分子拟肽已经引起了研究者的广泛关注,并将成为一个重要的研究前沿。方法本研究通过模拟CAMPs的结构与功能特性,以合成辣椒素和辣椒碱为原料,引入碱性氨基酸、烷基胺和胍基等获悉更多在生理条件下被质子化后带正电的亲水组分,并通过调节疏水链长Spine biomechanics平衡其两亲性,设计并合成一系列两亲性小分子抗菌拟肽。通过比较抗菌活性和溶血活性,进行构效关系分析,最终筛选得到具有优异广谱抗菌活性的候选抗菌剂CP51。接着,通过对候选化合物CP51进行细胞毒性、杀菌动力学、盐离子稳定性和耐药性研究等体外生物学评价,并通过小鼠细菌性角膜炎模型评价其局部应用的体内抗菌疗效,通过荧光素钠染色检查其角膜毒性。最后,对其进行初步的抗菌机制研究,包括SYTOX Green、N-苯基-1-萘胺摄取、Di SC_3(5)、BODIPY?-TR尸胺置换、LTA/LPS竞争性结合和抗生物膜活性等实验。结果1.本论文总共合成了26个全新结构的合成辣LY2157299抑制剂椒素和天然辣椒碱的衍生物用于构效关系的研究。其中,在合成辣椒素的苯环邻位的两侧上修饰己烷胍基的CP51被确定为候选化合物。2.在体外抗菌活性研究中发现其具有广谱抗菌活性。对革兰氏阳性细菌的MICs为0.39～0.78μg/m L,包括金黄色葡萄球菌ATCC 29213、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌NCTC 10442和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌N315,对革兰氏阴性菌的MICs为1.56～6.25μg/m L,包括铜绿假单胞菌ATCC 9027、鲍曼不动杆菌ATCC17978、鲍曼不动杆菌R2899、肺炎克雷伯杆菌ATCC 10031、肺炎克雷伯杆菌ATCC 14581和大肠杆菌ATCC 25922。3.通过进一步的体外生物学评价,发现其具有很弱的溶血活性(HC_(50)=134.8±4.6μg/m L)、较低的细胞毒性(CC_(50)>25μg/m L)、快速杀菌、体外耐盐性高和不易产生耐药性等特性。4.在体内抗菌疗效研究中,发现它在金黄色葡萄球菌及铜绿假单胞菌感染的小鼠细菌性角膜炎模型中显示出与万古霉素和妥布霉素相当的治疗效果,表明其在治疗细菌性角膜炎上具有较大的潜在应用价值。5.通过初步的抗菌机制研究,发现化合物CP51具有较强的膜亲和力和膜通透性,能够以膜破坏的方式杀死细菌,并具有较强的抗生物膜活性。结论本研究以合成辣椒素和辣椒碱为原料,通过模拟CAMPs,调节电荷/疏水平衡和系统结构优化,筛选得到候选化合物CP51。其具有高效低毒、快速杀菌和较强的抗生物膜活性等特性,通过膜破坏机制杀灭细菌,可有效避免耐药性的产生。更重要的是,它在金黄色葡萄球菌或者铜绿假单胞菌诱导的细菌性角膜炎小鼠模型中体现出较大的临床应用潜力。因此,本研究为克服抗生素耐药提供了一种极具希望的设计策略,并且为小分子抗菌拟肽研发提供了新思路和化合物基础。

表皮蜡质是苹果果实与Single Cell Sequencing外界环境接触的第一道屏障,在果实发育和品质保持中起着重要的作用。阐明苹果表皮蜡质合成及其调控的生理机制,是通过蜡质保持和改良苹果品质的重要理论前提。ERF2是乙烯信号转导途径中的重要转录因子,对植物发育、果实成熟、物质代谢和抵御外界胁迫等均有重要作用。研究表明,MdERF2表达受到乙烯调控,并可能在乙烯调控的苹果表皮蜡质合成中发挥了重要的作用。因此,深入研究MdERF2在苹果表皮蜡质合成代谢中的作用,筛选鉴定其调控苹果表皮蜡质合成的靶基因,阐明MdERF2调控苹果表皮蜡质合成的转录调控机理,对于深入解析MdERF2在乙烯通过苹果表皮蜡质调控果实品质中的作用具有重要的理论价值,也可为后续开发基于表皮蜡质的果实品质调控新技术提供靶点信息和理论支持。本文利用含有p RI101-MdERF2-OE(MdERF2超表达,ERF2-OE)、p RI101-MdERF2-RNAi(MdERF2沉默,ERF2-AN)及p RI101空载体(p RI101)的农杆菌(以清水处理为对照,CK)分别侵染富士苹果愈伤组织和果实,通过实时荧光定量聚合酶链式反应(q RT-PCR)、气相-质谱联用(GC-MS)和扫描电镜(SEM)技术分别研究了MdERF2超表达和沉默对苹果表皮蜡质合成相关基因表达、蜡质组成和形态结构的影响,然后利用凝胶阻滞分析(EMSA)和双荧光素酶报告基因(DLR)实验鉴定了MdERF2对苹果果实表皮蜡质合成关键基因MdLACS2、MdCER1、MdCER6的靶向调控效应,最后利用转录组学技术进一步揭示了MdERF2超表达和沉默对果实表皮蜡质合成相关基因表达和代谢通路的影响,主要结果如下:(1)在苹果愈伤组织和果实中,ERF2-OE均上调了蜡质合成基因MdLACS2、MdCER1、MdCER4、MdCER6的表达,ERF2-AN则均抑制了上述基因的表达,表明MdERF2正调控了上述基因的表达。(2)ERF2-OE显著提高了苹果表皮蜡质质量分布密度,而ERF2-AN则显著抑制了苹果表皮蜡质的合成,质量分布密度最低。在蜡质具体组成与含量上,ERF2-OE显著提高了苹果表皮总蜡质中烷烃和酮的比例,降低了脂肪酸和醇的比例;相反的,ERF2-AN处理则提高了表皮蜡质中脂肪酸和醇的比例,降低了烷烃和酮的比例。(3)CK与p RI101处理的苹果果实表皮蜡质均呈大块片状或无定形状附着在果实表面;ERF2-OE处理的果实表皮蜡质多以片状及条状紧实的堆积在果实表面;ERF2-AN的表皮蜡质则呈明显的碎片状,分布散且不紧实。(4)利用诱导纯化获得的MdERF2重组蛋白进行EMSA实验,发现MLBH589生产商dERF2蛋白与MdLACS2、MdCER1、MdCER6探针可以特异性结合;DLR实验进一步发现,效应载体p Green II-62SK-MdERF2分别与含有MdLACS2、MdCER1或MdCER6启动子的报告载体共同侵染的烟草叶片区域荧光强度均显著高于p Green II-62SK空载体与各报告载体共同侵染的区域(p<0.05),表明MdERF2增强了MdLACS2、MdCER1、MdCER6的转录活性,MdLACS2、MdCER1、MdCER6是MdERF2调控苹果表皮蜡质合成的靶基因。(5)ERF2-OE、ERF2-AN以及p RI101样品的转录组测序结果表明,三者之间共有157个相同的差异表达基因(DEGs),这些差异基因均在角质、软木脂、蜡质合成这一通路中有富集;ERF2-OE对蜡质合成中的多个关键酶,如β-酮脂酰-ACP还原酶、β-羟脂酰-ACP脱水酶、β-酮酰基辅酶A合成酶、脂酰基辅酶A还原酶以及醛脱羰酶等的编码基因均具有上调作用;此外,DEGs在泛醌等萜类化合物、类黄酮、油菜素甾醇等其它与蜡质合成相关的通路中也被富集,进一步表明MdERF2在转录水平上多方位参与了苹果表皮蜡Lorlatinib质合成的调控。

在妇科肿瘤中,OC因其晚期诊断、短期复发、易化疗耐药等特点,导致OC为死亡率最高的妇科恶性肿瘤~([1,2])。目前,卵巢癌的标准治疗包括肿瘤细胞减灭术,根据分期给以铂联合紫杉醇化疗,根据患者临床分期、初始治疗药物使用、基因状态,部分患者给予PARPi单药/联合贝伐株单抗维持治疗~([3])。虽然OC患者经规范的一线治疗,延长了部分患者的无进展生存期或延迟了复发,但OC的复发仍然难以避免~([2,4])。目前,70%的EOC患者初始治疗后三年之内复发~([2])。随着复发次数的增多、间隔缩短,患者最终由化疗敏感变成耐药,而类耐药是导致治疗失败的关键因素~([4,5]),迄今为止尚无针对化疗耐药患者有效的治疗方案。本研究从协同顺铂杀伤OC细胞和耐药细胞代谢组学改变两个角度分别对OC进行探究。第一部分主要探讨西达本胺通过靶向能量代谢协同顺铂杀伤卵巢癌细胞,第二部分旨在讨论卵巢癌耐药细胞的代谢组学研究。为OC患者治疗和克服耐药提供新的思路和策略。第一部分西达本胺通过靶向能量代谢协同顺铂杀伤卵巢癌细胞背景:卵巢癌(Ovarian cancer,OC)是全球女性肿瘤死亡的第8大原因、死亡率高居妇科肿瘤之首,其病理类型以上皮性为主(约90%)。在大多数上皮性卵巢癌(Epithelial ovarian cancer,EOC)中,表观遗传变化明显,组蛋白脱乙酰酶(HDACs)的过表达是重要的表现。组蛋白去乙酰化酶抑制剂(histone deacetylase inhibitor,HDACi)改变正常和转化细胞中的组蛋白去乙酰化,破坏癌细胞的周期和激活细胞凋亡,从而起到抗肿瘤作用。最近研究显示,HDACi可以通过作用于糖酵解和氧化途径的单个或多个酶来影响增殖。体内、体外实验及临床试验表明,HDACi可能是具有广泛应用前途的抗肿瘤药物,已证明对OC具有抗癌作用。西达本胺(Chidamide,Chi)是一种新型苯甲酰胺HDAC抑制剂,能选择性抑制HDAC1、2、3、10。目前,Chi正在美国和中国进行用于治疗包括OC等多种实体瘤的临床试验。虽然之前的体内、体外实验研究表明,HDACi与卡铂联合治疗具有协同抗肿瘤作用,但Chi对OC的作用效果及机制研究不足,尚未明确Chi与OC一线化疗药物顺铂(cisplatin,CDDP)联合治疗是否具有协同效果,需要更多基础研究支持相关临床试验。本研究进一步探索Chi、CDDP单药或联合对卵巢癌增殖、凋亡、代谢的影响。以卵巢细胞系A2780(BRCA野生型)和COV362(BRCA突变型)为模型,观察Chi、CDDP单药及联合于体内、体外对卵巢癌细胞生长的影响及机制进行探索;并以糖酵解、线粒体压力变化为基础,研究Chi、CDDP单药及联合于体外对卵巢癌细胞系A2780及COV362能量代谢的影响,发现Chi、CDDP联合治疗调控代谢酶转录,CDDP、Chi联合治疗特异性增强PDK4表达抑制OXPHOS;进一步研究发现PDK4的表达诱发OC细胞代谢重编程,影响OC细胞克隆、迁移、侵袭及对Chi、CDDP敏感性,为OC患者治疗提供新的思路和策略。目的:1.明确Chi+CDDP对OC细胞是否具有协同作用;探索Chi、CDDP单药及联合对OC细胞增殖、凋亡的影响,并于体内实验进一步验证;2.明确Chi、CDDP单药及联合对OC细胞代谢的影响;3.探索Chi、CDDP联合对OC细胞代谢酶转录影响,发现特异性改变PDK4转录及翻译;4.探索PDK4对OC细胞的生物功能及代谢的影响;5.体内实验验证PDK4对OC细胞增殖、药物敏感性影响。方法:1.采用CCK-8法分别检测CDDP、Chi对A2780、COV362的抑制作用,用细胞抑制率与剂量浓度作图,并求出各自IC50值;2.选取CDDP、Chi不同低浓度做联合实验,用金式公式计算其联合用药的Q值,根据Q值判断CDDP、Chi联合用药对OC细胞的作用;3.利用Agilent Seahorse XF能量代谢检测技术检测CDDP、Chi单药及联合作用后A2780、COV362细胞糖酵解压力及线粒体压力变化;4.利用Western Blot技术检测CDDP、Chi单药及联合作用后A2780、COV362细胞线粒体损伤、凋亡、糖代谢相关蛋白的表达水平;5.应用q-PCR技术检测CDDP、Chi单药及联合作用后A2780、COV362细胞糖代谢相关的蛋白的m RNA表达情况;6.使用慢病毒感染的方法对OC细胞敲减/过表达PDK4,利用Agilent Seahorse XF能量代谢检测技术检测PDK4表达对OC细胞能量代谢影响;7.探究PDK4的敲减/过表达对OC细胞克隆、迁移、侵袭及凋亡的影响;8.利用Western Blot技术检测OC细胞中敲减/过表达PDK4后糖代谢、Akt-m TOR信号通路、凋亡通路相关蛋白的表达水平;9.利用BALB/c雌性小鼠皮下移植A2780-OE-PDK4,A2780-KD-PDK4细胞来建立OC移植瘤模型,随机分,给予药物治疗,停药后观察各组小鼠生存期。结果:1.Chi、CDDP对卵巢癌细胞具有抑制增殖作用;Chi联合CDDP对卵巢癌细胞增殖抑制和促凋亡具有协同作用;体内实验显示,Chi联合CDDP可以延长OC种植瘤模型小鼠的生存期;2.Chi联合CDDP抑制OC细胞能量代谢,显著降低糖酵解和线粒体压力代谢;3.Chi联合CDDP,激活线粒体凋亡途径,降低糖酵解途径蛋白表达,下调p-m TOR、c-Myc表达;4.Chi联合CDDP影响代谢酶转录,增强PDK4表达抑制OXPHOS;5.PDK4过表达增强OC细胞的克隆、侵袭及迁移能力;敲减PDK4可导致OC细胞克隆、侵袭及迁移能力减弱;6.PDK4过表达在体外、体内增强OC细胞对CDDP耐药性,并下调线粒体凋亡途径;7.PDK4过表达上调OC细胞的能量代谢,糖酵解能力升高;敲减General EquipmentPDK4下调OC细胞多个糖代谢蛋白表达、能量代谢能力减弱,糖酵解能力显著降低;OXPHOS的变化在细胞间存在差异,可能与BRCA突变有关;8.PDK4过表达可激活OC细胞Akt-m TOR信号通路;在PDK4敲减细胞中,下调p-m TOR,上调LC3Ⅱ/LC3Ⅰ。结论:1.Chi联合CDDP在体内、体外对OC细胞具有协同抑制增殖和促凋亡作用;2.Chi联合CDDP降低OC细胞糖酵解能力,可能与糖酵解相关蛋白、p-m TOR、c-Myc表达下调有关;3.Chi联合CDDP影响代谢酶转录,增强PDK4表达抑制OXPHOS;并通过激活线粒体凋亡途径来诱导肿瘤细胞凋亡;4.PDK4的表达影响OC细胞体外克隆、迁移、侵袭能力,并影响细胞对CDDP的化疗药物的敏感性及CDDP引起的线粒体凋亡途径;5.敲减PDK4表达抑制OC细胞糖酵解限速酶表达、抑制能量代谢、糖酵解能力显著减弱;PDK4过表达引起OC细胞的能量代谢升高,糖酵解能力显著升高;OXPHOS的变化在细胞间存在差异,可能与BRCA突变有关;6.PDK4对OC细胞生物功能的调节,可能与PI3K/Akt信号通路有关。第二部分卵巢癌耐药细胞的代谢组学研究背景:卵巢癌(Ovarian cancer,OC)在女性生殖系统肿瘤发病率位于第三,但却是女性生殖系统死亡率最高的恶性肿瘤。目前,美国国家综合癌症网络(National Comprehensive Cancer Network(?),NCCN(?))对于OC提出的标准治疗方案是肿瘤细胞减灭术,根据术后病理分期给予以铂为基础联合多烯紫杉醇全身周期性化疗3-6个疗程,根据患者基因状态及临床分期、周期性化疗期间是否联合血管抑制剂等综合因素,化疗结束后给予聚腺苷二磷酸-核糖聚合酶抑制剂(poly-ADP-ribose polymerase inhibitor,PARPi)单药/联合贝伐珠单抗维持治疗。即使经过手术、化疗、靶向药物维持治疗等规范治疗,OC的复发仍然难以避免,复发、耐药的产生是OC患者治疗失败、高死亡率的主要原因,但导致其复发、耐药的机制尚不明确。癌细胞的一个标志性特征是能MEK抑制剂够重新编程新陈代谢以维持肿瘤生长的有利环境。OC是一种异质性肿瘤,不同病理类型呈现不同的代谢特征,对于耐药性卵巢癌,代谢变化更加复杂,同时代谢途径对癌细胞的生长、耐药、转移起着重要作用。因此,揭示OC耐药细胞代谢重编程的分子机制是亟待解决的问题之一;对OC的治疗及预后具有非常重要的意义。代谢组作为继基因组学、转录组学、蛋白组学之后的又一新兴学科,是指存在于细胞、组织、器官或生物体内并具有广泛功能的代谢物的总数。代谢物不但是细胞代谢的产物和底物,也反映了与肿瘤发生、发展相关的细胞功能的变化,如细胞增殖、凋亡、转移。因此,代谢物水平的变化可作为诊断、预后标志物,也可作为治疗靶点。本研究通过构建卵巢癌细胞A2780对顺铂(Cisplatin/CDDP)耐药细胞ARC、对紫杉醇(Paclitaxel/PTX)耐药细胞ARP、对奥拉帕利(Olaparib/Ola)耐药细胞ARO的耐药细胞模型。运用超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱(ultra performance liquid chromatography-quadrupole time-of-flight mass spectrometry,UHPLC-Q-TOF-MS)进行非靶向代谢组学检测,并对差异性代谢物进行生物信息学的功能分析,探索ARC、ARP、ARO细胞耐药的代谢机制,为逆转卵巢癌一线化疗药物及靶向维持药物耐药提供新的思路和策略。目的:1.构建A2780的顺铂耐药细胞ARC、紫杉醇耐药细胞ARP、奥拉帕利耐药细胞ARO的耐药细胞模型,在此基础上,探索CDDP、PTX、Ola耐药的分子机制;2.明确CDDP暴露对A2780和ARC细胞代谢的影响;PTX暴露对A2780和ARP细胞代谢的影响;Ola暴露对A2780和ARO细胞代谢的影响;3.探索CDDP、PTX、Ola暴露对A2780和耐药细胞差异代谢物富集通路的影响,分析耐药代谢标记物、通路以及潜在的逆转耐药的通路。方法:1.通过浓度梯度递增法构建A2780细胞对卵巢癌一线化疗药物(顺铂、紫杉醇、奥拉帕利)的耐药细胞,分别简称ARC、ARP、ARO;2.采用CCK8检测,A2780、ARC、ARP和ARO细胞对CDDP、PTX及Ola的IC50值,计算耐药指数;通过细胞增值实验、生长曲线、克隆实验及凋亡实验,验证耐药细胞的耐药性及稳定性;3利用UHPLC-Q-TOF-MS技术检测A2780、ARC及CDDP处理A2780(A2780-CDDP)和ARC(ARC-CDDP)组间差异代谢物;并对差异性代谢物进行生物信息学的功能分析;4.利用UHPLC-Q-TOF-MS技术检测A2780、ARP及PTX处理A2780(A2780-PTX)和ARP(ARP-PTX)组间差异代谢物;并对差异性代谢物进行生selleck抑制剂物信息学的功能分析;5利用UHPLC-Q-TOF-MS技术检测A2780、ARO及Ola处理A2780(A2780-Ola)和ARO(ARO-Ola)组间差异代谢物;并对差异性代谢物进行生物信息学的功能分析。结果:1.成功构建耐药细胞ARC、ARP、ARO,耐药细胞系增殖减慢;分别对CDDP、PTX、Ola引起的增殖抑制、促进凋亡作用敏感性降低;2.对ARC vs A2780及ARC-CDDP vs A2780-CDDP的差异代谢物进行鉴定、互作分析,结合KEGG分析结果,鉴定出A2780对顺铂耐药代谢标记物为N-(十八烷基)-鞘-4-烯嘌呤-1-磷酸胆碱,UDP-N-乙酰葡糖胺,L-瓜氨酸,DL-脯氨酸,UDP-半乳糖,缬氨酸;顺铂耐药通路有丙氨酸代谢,中枢碳代谢,嘧啶代谢,氨基糖和核苷酸糖代谢,谷氨酸代谢,精氨酸代谢,天门冬氨酸代谢,m TOR信号通路,ABC转运蛋白通路;3.对ARC vs A2780及ARC-CDDP vs A2780-CDDP的差异代谢物进行KEGG分析仅在顺铂暴露组异常富集的通路:乙醛酸和二羧酸代谢,2-氧代羧酸代谢,苯丙氨酸、甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸和色氨酸和脯氨酸代谢和鞘脂信号通路;4.对ARP vs A2780及ARP-PTX vs A2780-PTX的差异代谢物进行鉴定、互作分析,结合KEGG分析结果,鉴定出A2780对紫杉醇耐药的代谢标记物为异亮酰脯氨酸,脱氧肌苷,脱氧胸苷,肌醇,烟酰胺;紫杉醇耐药通路有丙氨酸代谢,谷氨酸代谢,天冬氨酸代谢,嘧啶代谢,半乳糖代谢,苯丙氨酸代谢,ABC转运蛋白,神经活性配体-受体相互作用通路;5.对ARP vs A2780及ARP-PTX vs A2780-PTX的差异代谢物进行KEGG分析仅在紫杉醇暴露组异常富集的通路:磷酸戊糖途径,氨基糖和核苷酸糖代谢,甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢,精氨酸生物合成,嘌呤代谢和鞘脂信号通路;6.对ARO vs A2780及ARO-Ola vs A2780-Ola的差异代谢物进行鉴定、互作分析,结合KEGG分析结果,鉴定出A2780对奥拉帕利耐药的代谢标记物为N-乙酰天冬氨酸谷氨酸,N-乙酰基-L-天冬氨酸-L-谷氨酸,吡啶,乙酰胆碱,L-棕榈酰肉碱,肌醇,烟酰胺;奥拉帕利耐药通路有中枢碳代谢,丙氨酸代谢,谷氨酸代谢,苏氨酸代谢,天冬氨酸代谢,丝氨酸代谢,癌症中的胆碱代谢,甘油磷脂代谢,神经活性配体-受体相互作用,ABC转运体通路;7.对ARO vs A2780及ARO-Ola vs A2780-Ola的差异代谢物进行KEGG分析仅在奥拉帕利暴露组异常富集的通路:淀粉和蔗糖代谢,半乳糖代谢,2-氧代羧酸代谢通路,牛磺酸和次牛磺酸代谢,泛酸盐和辅酶A的生物合成。结论:1.耐药细胞ARC、ARP、ARO共有耐药代谢标记物肌醇、烟酰胺;共性耐药通路包括中枢碳代谢,丙氨酸代谢,谷氨酸代谢,天冬氨酸代谢ABC转运体通路,神经活性配体-受体相互作用通路;共性潜在逆转耐药通路2-氧代羧酸代谢通路、甘氨酸代谢、鞘脂信号通路、丝氨酸代谢、苏氨酸代谢;2.A2780顺铂耐药的特异性通路有m TOR信号通路,氨基糖和核苷酸糖代谢,谷氨酸代谢,精氨酸代谢,天门冬氨酸代谢;逆转A2780顺铂耐药的潜在通路有苯丙氨酸,酪氨酸,脯氨酸,色氨酸,乙醛酸和二羧酸代谢;3.A2780紫杉醇耐药的特异性通路有半乳糖代谢,苯丙氨酸代谢;逆转A2780紫杉醇耐药的潜在通路有氨基糖和核苷酸糖代谢,精氨酸代谢,磷酸戊糖途径,嘌呤代谢;4.A2780奥拉帕利耐药特异性通路有癌症中的胆碱代谢,甘油磷脂代谢,丝氨酸代谢,苏氨酸代谢;逆转A2780奥拉帕利耐药的潜在通路半乳糖代谢,淀粉和蔗糖代谢,泛酸盐和辅酶A的生物合成,牛磺酸和次牛磺酸代谢。

棉花抗病种质缺乏和病原菌变异频繁等原因导致棉花抗黄萎病育种及综合防治成为生产上亟待解决的问题。尽管真菌的致病性和植物免疫已被广泛研究,但对于落叶型大丽轮枝菌与棉花互作机制仍知之甚少。利用多组学解析棉花与大丽轮枝菌的互作机制可为解决棉花抗黄萎病提供理论参考,通过诱导棉花免疫激活激发子的鉴定可用于抗黄萎病棉花种质创新。本研究通过双向转录组分析揭示了棉花与病原在互作过程中分子调控网络的变化,发现棉花与病原在不同侵染阶段可能的互作方式的转变。利用棉花根系与大丽轮枝菌早期互作的比较转录组和分泌蛋白组,鉴定到病原可诱导棉花免疫激活的激发子VP2。VP2在棉花中异源超量表达可提升棉花对大丽轮枝菌的抗性,实现抗黄萎病的种质创新。本研究主要结果如下:1.棉花与大丽轮枝菌互作的双向转录组分析本研究分别对落叶型大丽轮枝菌V991和非落叶型大丽轮枝菌1cd3-2侵染的棉花下胚轴进行转录组测序,并将测序所得reads分别匹配到棉花与大丽轮枝菌基因组。通过对棉花在不同时间点特异响应大丽轮枝菌的差异表达基因(Differentially Expressed Genes,DEGs)的GO富集分析,发现棉花在接种后3-9 d,响应病原入侵过程中参与细胞壁合成相关路径的基因被显著富集;在接种12-21 d,棉花体内参与免疫反应等相关的基因被显著富集,并且与早期阶段相比发生明显的活性氧爆发及抗氧化酶活性的升高。进一步研究显示高浓度的过氧化氢(5 m M)能明显杀死棉花原生质体细胞。因此本研究认为棉花黄萎病的叶片黄化、坏死症状可能与ROS的过度积累有关。通过对V991和1cd3-2的比较转录组分析,发现6类与大丽轮枝菌毒力相关的基因在转录水平上的差异表达可能是引起大丽轮枝菌毒力分化的原因之一。尤其在接种后12-21 d,V991中参与毒力相关的基因被显著诱导表达。此外,大丽轮枝菌特异基因也可能是引起毒力分化的重要原因。结合大丽轮枝菌的比较基因组鉴定到V991特异分泌蛋白SP3和SP6,q RT-PCR结果显示其均在V991侵染棉花12-21 d表达升高。利用同源重组对V991基因组中的SP3和SP6进行敲除,发现SP3和SP6的敲除突变体菌丝生长速率不变,但SP3的敲除突变体对棉花的致病力明显降低,暗示着SP3可能是落叶型大丽轮枝菌导致棉花病害的关键毒力因子之一。综合棉花与病原的双向转录组分析,本研究认为棉花与大丽轮枝菌在互作过程中可明确分为两个不同的阶段:3-9 d为早期互作阶段,本阶段中植物主要依靠细胞壁等结构抗性抵抗病原菌的入侵,相应地,大丽轮枝菌在这一阶段中参与代谢和blood‐based biomarkers抑制植物免疫等相关基因被显著诱导;12-21 d为后期互作阶段,本阶段中植物体内发生了免疫反应的过度激活,这可能是导致棉花病症的主要原因之一;相应地,大丽轮枝菌在后期互作阶段分泌大量的效应子,激活植物体内的免疫反应,加速植物发病。2.利用大丽轮枝菌激发子VP2激活植物免疫,提高棉花对大丽轮枝菌的抗性V991和1cd3-2与抗病棉花品系Hai7124和感病棉花品系YZ1互作3天的比较转录组分析,显示V991在早期与棉花根系互作过程中有更多的DEMG132 IC50Gs上调表达。结合V991的分泌蛋白组,筛选到10个V991特异受诱导的分泌蛋白(VPs)。VPs注射烟草叶片48 h的q RT-PCR结果显示,VP2能显著激活烟草叶片中HR和PTI相关基因的表达。VP2在菌丝入侵早期受诱导高度上调表达,并且能诱导多种植物叶片的坏死。亚细胞定位的结果显示VP2定位在烟草细胞膜上。VIGS实验证实VP2诱导烟草叶片的坏死依赖于Nb BAK1,但不依赖于Nb SOBIR1。对VP2(VP2在V991基因组中的基因型)和ND-type VP2(VP2在1cd3-2基因组中的基因型)的蛋白序列比对分析,显示两种基因型保守性很强,仅在信号肽区域存在两个氨基酸的变异,但在入侵棉花过程中,非落叶型大丽轮枝菌中NDtype VP2几乎未被诱导。通过同源重组的方法,对V991基因组中的VP2进行敲除与回补,发现VP2敲除转化子不影响V991的菌丝生长,但对棉花的致病性明显降低,说明VP2对V991的毒力发挥重要作用。进一步,将VP2异源超表达到棉花体内,获得的VP2转基因棉花表现出对大丽轮枝菌的抗性显著增强,而不影响其生长发育。RNA-seq的结果显示,VP2转基因棉花相比野生型对照,DEGs显著富集在细胞壁修饰、对真菌的响应、木质素代谢和激素代谢等过程。参与植物免疫反应相关的基因如几丁质酶、OSM34和过氧化物酶等在VP2转基因棉花接菌前后的表达均高于野生型对照。q RT-PCR的结果显示,OEVP2转基因棉花中参与JA和SA信号转导相关基因被显著激活,JA和SA的激素含量也明显高于野生型对照。此外OEVP2转基因PEG300核磁棉花中参与木质素合成相关的基因Gh PALs在接菌前后均被显著激活,木质素含量也显著增加。以上结果表明VP2可作为一个激发子,用于棉花抗病种质创新。综上所述,本研究利用棉花与大丽轮枝菌双向转录组分析发现棉花与大丽轮枝菌的互作存在阶段性免疫调控的转变,这使我们对植物与真菌的互作有了新的认识。同时,通过对病原早期与棉花根系互作的转录组和分泌蛋白组的分析,鉴定到V991关键的激发子VP2。利用VP2转化棉花获得了抗病性显著增强的棉花新种质,丰富了创制抗黄萎病棉花种质的手段。

为了了selleck LBH589解广西地区奶牛、肉牛的牛库布病毒(bovine Kobuvirus, BKV)感染情况及分子特征，试验采用RT-PCR的方法对从广西地区采集的奶牛粪便177份、肉牛粪便27份(共204份粪便，其中腹泻牛粪便82份，健康牛粪便122份)进行BKV和其他肠道病毒的检测，分析BKV与其他肠道病毒的共感染情况，以及不同地点和不同季节BKV的感染情况，同时对广西地区BKV的3D基因与国内外30株库布病毒的3D基因进行核苷酸序列同源性分析和遗传进化分析。结果表明：广西地区BKV的感染率为2.94%(6/204),均从腹泻牛粪便中检出，其中奶牛和肉牛的感染率分别为2.26%(4/177)、7.41%(2/27),将6株毒株分别命名为BKV-GXGG01(贵港株)、BKV-GXHC01(河池株)、BKV-GXHC02(河池株)、BKV-GXNN01(南宁株)、BKVselleck HPLC-GXNN02(南宁株)和BKV-GXNN03(南宁株);BKV与牛病毒性腹泻病毒、牛肠道病毒和牛星状病毒存在混合感染，感染率为66.67%(4/6),而单一感染率为33.33%(2/6);6株广西地区BKV毒株的3D基因间的核苷酸序列同源性为93.5%～100%,与国内外Aichivirus B类型参考毒株间的核苷酸序列同源性为89.9%～95.1%,与其他库布病毒参考毒株的核苷酸同源性为35.9%～75.2%;6株广西地区毒株在遗传进化分析中均属于Aichivirus B类型，毒株Aqueous mediumBKV-GXNN01与日本株K-35、河南株B4、内蒙古株H6和H18、山东株C2、黑龙江株SC7-5、辽宁株H9同属一分支，其余5株毒株BKV-GXGG01、BKV-GXHC01、BKV-GXHC02、BKV-GXNN02、 BKV-GXNN03与北京株B1213、泰国株CMB02、日本株U-1同属一分支。说明在广西地区奶牛、肉牛的腹泻病例中均存在BKV感染，推测BKV可能与牛腹泻有关。

目的 对细胞色Transmembrane Transporters抑制剂素P450 2C19(CYP2C19)*2和CYP2C19*3单核苷酸多态性分型的实验室自建焦磷酸测序法进行性能验证，确保其能为临床提供准确可靠的结果。方法 通过对梯度稀释的杂合型基因组DNA(gDNA)标本(10.0、2.0、0.4 ng/μL)进行检测，评价方法的最低检测浓度；比较焦磷酸测序和Sangbioelectric signalinger测序结果，评价方法的准确度；将经焦磷酸测序验证的野生型gDNA标本进行Sanger测序，评价方法的特异度；对杂合型gDNA标本重复检测4次，评价方法的重复性。结果 焦磷酸测序检测CYDNA Damage/DNA Repair抑制剂P2C19*2和CYP2C19*3单核苷酸多态性的最低检测浓度为0.4 ng/μL;20份临床gDNA标本的焦磷酸测序结果与Sanger测序结果一致，准确度为100%;10份野生型的临床gDNA标本经Sanger测序验证均为野生型，特异度为100%;分别对CYP2C19*2和CYP2C19*3的杂合型gDNA标本重复检测4次，重复性好，变异系数均<5%。结论 焦磷酸测序检测CYP2C19*2和CYP2C19*3单核苷酸多态性的结果准确可靠，能够为临床使用氯吡格雷、质子泵抑制剂等药物提供个体化指导。