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目的:探讨7例多发性骨髓瘤(multiple myeloma, MM)继发Ⅰ型冷Gefitinib核磁球蛋白血症(cryoglobulinemia, CG)患者的临床特征、治疗及转归。方法:回顾性分析2015年1月—2023年3月北京协和医院确诊的7例MM继发Ⅰ型CG患者的临床资料、治疗方案和生存结局。结果:7例患者中，男5例，中位诊断年龄为56(40～71)岁。4例继发于冒烟型骨髓瘤。CG受累器官包括皮肤(n=5)、周围神经(n=4)、关节(n=4)和肾脏(n=1)。中位冷球蛋白水平diABZI STING agonist为13 046.5(693.8～33 988.0) mg/L,所有患者均为IgG单克隆型冷球蛋白，与M蛋白类型一致。7例患者均接受了抗浆细胞治疗，其中1例因CG相关急性肾衰竭同时进行了血浆置换。6例有随访资料的患者均获得了MM血液学缓解，4例有CG相genetic clinic efficiency关症状者均达到临床缓解。中位随访37(10～45)个月后，1例失访，1例因治疗相关感染死亡。结论:MM是Ⅰ型CG相对少见病因，对于有皮肤、周围神经、关节等受累表现的MM患者，应考虑到继发性CG的可能。

卵巢癌是一种对铂类药物敏感的肿瘤,一线常规治疗通常有较高的疗效。然而,75%的晚期患者在接受顺铂(Cis[Pt Cl_2(NH_3)_2],DDP)治疗一段时间后仍会发生转移和/或复发,顺铂耐药性最终会影响癌症患者的长期生存率。卵巢癌对顺铂耐药的机制很复杂,研究表明,它可能与药物外排增加、表观遗传改变、DNA修复增强和自噬激活有关。尽管自噬在肿瘤形成过程中的促生长和促死亡作用仍有争议,大量研究支持在化疗药物引起的微环境压力下,肿瘤细胞将刺激自噬作为对抗化疗药物细胞毒性的保护机制,最终导致化疗耐药性的出现。铁死亡是一种铁依赖性的细胞程序性死亡方式。在二价铁离子或酯氧合酶的作用下,催化细胞膜上不饱和脂肪酸发生脂质体过氧化,从而诱导细胞死亡。某些耐药肿瘤细胞,特别是间充质状态的、易转移的肿瘤细胞,极易发生铁死亡,但具体机制不明。因此,明确耐药卵巢癌细胞对铁死亡激活剂的易感性可能为卵巢癌临床治疗提供新的视角。抗氧化体系失活和铁代谢紊乱是影响细胞铁死亡敏感性的重要因素。一种被称为x CT(SLC7A11)的胱氨酸-谷氨酸反转运蛋白有助于从头合成抗氧化剂谷胱甘肽(Glutathione,GSH)。GSH在催化磷脂氢过氧化物解毒中的作用对细胞生存至关重要。GSH也是谷胱甘肽过氧化物酶(Glutathione Peroxidase 4,GPX4)的底物。因此,半胱氨酸剥夺和GPX4抑制可以有效地诱导铁死亡。GPX4抑制剂RSL3以及SLC7A11的直接抑制剂Erastin被广泛用于诱导铁死亡。增加铁的吸收,减少铁的储存和限制铁的外流都会导致铁积累增加,促进铁死亡。转铁蛋白通过介导铁摄取影响细胞铁积累,而铁蛋白的合成和降解均能影响铁水平。细胞质中过量的铁离子储存在由铁蛋白重链FTH1和铁蛋白轻链FTL1组成的铁蛋白复合体中。与对铁死亡敏感的细胞相比,FTH1和FTL1在对铁死亡不敏感的细胞中的表达量显著增加。最近的研究指出,铁死亡可能是自噬依赖性的。这是因为对铁死亡激活剂的反应导致自噬体的积累,而自噬机制的成分有助于铁死亡的发生。此外,铁蛋白的自噬降解可以增加细胞内的不稳定铁离子水平,使细胞对铁死亡更加敏感。本研究通过使用两个卵巢癌亲本和顺铂耐药细胞系,我们发现顺铂耐药的卵巢癌细胞对铁死亡诱导剂Erastin更敏感。进一步研究发现,顺铂耐药细胞的高自噬水平导致了游离铁离子水平的增加。动物实验表明Erastin和DDP联合应用对耐药卵巢癌细胞具有良好的治疗效果。重要的是,自噬抑制分子AKT1在顺铂治疗不敏感卵巢癌患者中表达显著降低。因此,我们假设顺铂耐药卵巢癌细胞通过维持高自噬水平应对化疗压力,这种自噬状态启动了铁蛋白FTH1/FTL1的降解并导致铁离子的释放,进而导致顺铂耐药卵巢癌细胞对铁死亡诱导剂更加敏感。本研究旨在阐明铁死亡与卵巢癌顺铂耐药之间的联系,为明确AKT1/FTH1途径在顺铂耐药卵巢癌铁死亡中的作用提供科学依据,对靶向铁死亡途径逆转顺铂耐药提供新的策略。方法:1.顺铂耐药卵巢癌细胞铁死亡敏感性增加(1)顺铂耐药卵巢癌细胞株的验证SKOV3和A2780顺铂耐药卵巢癌细胞株(记为Res)及亲本细胞株(记为Par)由课题组前期构建,实验前分别经0、2.5、5、10及20μM顺铂处理,CCK8法检测亲本细胞和耐药细胞活力。(2)顺铂耐药卵巢癌细胞对铁死亡敏感性增加使用20μM Erastin对卵巢癌亲本及耐药细胞株处理24h,CCK8法评估细胞活力。ELISA法检测MDA、GSH、SOD水平,铁离子比色法检测游离铁水平。荧光探针染色检测ROS水平。Ferrostatin-1预处理细胞后再经Erastin杀伤,CCK8法评估细胞活力以明确顺铂耐药卵巢癌细胞对铁死亡敏感性增加。2.靶向铁死亡途径逆转卵巢癌顺铂耐药(1)Erastin增强顺铂对耐药卵巢癌细胞的杀伤针对SKOV3-Res及A2780-Res细胞分别进行顺铂单药或顺铂联合Erastin处理。使用CCK8法测定细胞活力,使用钙黄绿素/PI分别对活/死细胞进行染色以判NSC 119875断凋亡率。(2)Erastin增强顺铂对小鼠卵巢癌耐药模型的治疗效果将2×10~6个SKOSecond-generation bioethanolV3-Res细胞悬液对C57BL/6雌性小鼠进行腹腔注射,制备卵巢癌腹腔转移模型。一周后,小鼠接受三种不同治疗:对照(DMSO,0.05%)、DDP(4mg/kg)或DDP(4mg/kg)+Erastin(1mg/kg)。小鼠每3天腹腔注射一次药物,持续4周。统计小鼠生存时间,腹水量,腹壁转移瘤数目,HE染色检测转移瘤对腹壁侵犯情况。3.顺铂耐药卵巢癌细胞通过FTH1自噬降解对铁死亡易感(1)顺铂耐药卵巢癌的Erastin敏感性不依赖于铁死亡防御系统分别在有/无Erastin处理条件下对亲本及DDP耐药的SKOV3及A2780细胞中GPX4、NRF2和SLC7A11蛋白水平进行Western Blot检测。RT-PCR对NRF2靶基因HO1和NQO1进行检测。(2)铁蛋白FTH1在顺铂耐药卵巢癌细胞中下调分别在有/无Erastin处理条件下对亲本及DDP耐药的SKOV3及A2780细胞中铁蛋白FTL1及FTH1进行Western Blot检测。RT-PCR法检测铁蛋白FTL1及FTH1的m RNA表达。(3)FTH1在顺铂耐药卵巢癌细胞中降解增加以10μ/m L放线菌酮(Cycloheximide,CHX)处理细胞阻断新蛋白的合成,以观察FTH1在亲本细胞和耐药细胞中的蛋白稳定性。FTH1质粒转导SKOV3-Res和A2780-Res细胞后,以活/死染色和CCK8法检测细胞对Erastin诱导的铁死亡的反应。(4)顺铂耐药卵巢癌细胞自噬水平增加透射电镜观察了顺铂耐药卵巢癌细胞及亲本细胞的自噬小体,免疫荧光染色检测顺铂耐药卵巢癌细胞及亲本细胞中自噬标志物LC3b的表达。使用自噬抑制剂3-MA处理后,Western Blot检测FTH1蛋白的表达情况,CCK8法评价顺BMN 673化学结构铂耐药卵巢癌细胞对Erastin杀伤的敏感性。4.顺铂耐药卵巢癌细胞中AKT1缺失介导FTH1自噬降解(1)基于GEO数据库筛查卵巢癌顺铂耐药差异基因通过对GEO数据库GSE23603中17例顺铂治疗完全应答(Complete response,CR)患者和10例不完全应答(Incomplete response,IR)患者的测序结果进行比对,分析顺铂耐药的差异基因,KEGG分析差异基因所富集的分子通路,免疫组化染色检测CR与IR患者卵巢癌组织AKT1的表达。(2)AKT1缺失与卵巢癌预后的关联分析通过TCGA数据库分析AKT1表达水平与卵巢癌预后的关系。AKT1由中位表达水平分为高表达组及低表达组,Nomogram模型用于评估卵巢癌患者AKT1丢失的风险。(3)AKT1缺失上调顺铂耐药卵巢癌细胞自噬水平在SKOV3-Res和A2780-Res细胞中转导外源性AKT1,Western Blot检测AKT1、LC3b、p-ULK1及FTH1的表达。CCK8法检测在顺铂耐药的卵巢癌细胞中恢复AKT1表达后,Erastin诱导的细胞铁死亡情况。结果:1.顺铂耐药卵巢癌细胞铁死亡敏感性增加(1)顺铂耐药卵巢癌细胞株的验证与亲本细胞相比,SKOV3-Res细胞对顺铂具有更强的耐药性(IC50/SKOV3-Par=10.717,IC50/SKOV3-Res=23.830)。与亲本细胞相比,A2780-Res细胞对顺铂具有更强的耐药性(IC50/A2780-Par=9.528,IC50/A2780-Res=25.591)。以上结果说明,SKOV3和A2780顺铂耐药卵巢癌细胞株构建成功。(2)顺铂耐药卵巢癌细胞对铁死亡敏感性增加(1)使用20μM Erastin对卵巢癌亲本及耐药细胞株处理24h,CCK8法评估细胞活力,与亲本细胞相比,SKOV3-Res细胞和A2780-Res细胞活力均显著降低。Erastin处理后,与亲本细胞相比,SKOV3-Res和A2780细胞中SOD和GSH水平均显著降低,MDA水平增加。细胞铁积累是铁死亡的典型标志之一,Erastin处理后,顺铂耐药的SKOV3和A2780细胞中亚铁离子水平均显著高于亲本细胞。脂质ROS的增加是细胞发生铁死亡的重要特征,Erastin处理后SKOV3-Res及A2780-Res细胞中的ROS水平显著高于对应的亲本细胞。(2)预先使用10μM Fer-1处理细胞2h后评估Erastin的杀伤效果,发现抑制铁死亡途径挽救了Erastin对亲本和顺铂耐药卵巢癌细胞的杀伤。这些结果说明,与亲本细胞相比,顺铂耐药卵巢癌细胞具有高铁死亡敏感性。2.靶向铁死亡途径逆转卵巢癌顺铂耐药(1)Erastin增强顺铂对耐药卵巢癌细胞的杀伤相比于单独顺铂治疗,顺铂联合Erastin处理导致耐药卵巢癌细胞细胞活力显著降低,凋亡率显著增加。提示,在体外实验中Erastin增强顺铂对耐药卵巢癌细胞的杀伤。(2)Erastin增强顺铂对小鼠卵巢癌耐药模型的治疗效果与单独DDP治疗组小鼠相比,DDP+Erastin联合治疗组小鼠的腹壁转移性肿瘤更少,DDP+Erastin联合治疗组小鼠的转移瘤对腹壁的侵袭更低,腹水体积更小,中位生存时间更长。以上结果说明,Erastin与顺铂联合治疗在体外及体内实验中均表现出对顺铂耐药卵巢癌更强烈的杀伤效果。3.顺铂耐药卵巢癌细胞通过FTH1自噬降解对铁死亡易感(1)顺铂耐药卵巢癌的Erastin敏感性不依赖于铁死亡防御系统(1)在未经Erastin杀伤的情况下,铁死亡防御系统的关键分子在SKOV3-Res细胞中的表达显著高于SKOV3-Par细胞。Erastin显著诱导了NRF2和SLC7A11的上调,且不改变SKOV3-Res细胞及SKOV3-Par细胞的表达差异。然而,Erastin对SKOV3-Res细胞中的GPX4表达呈现强烈的抑制作用。经Erastin治疗后,GPX4在SKOV3-Res细胞中的表达显著低于其亲本细胞。(2)在未经Erastin杀伤的情况下,GPX4、NRF2和SLC7A11在A2780-Res细胞中的表达显著高于A2780-Par细胞。Erastin处理导致了GPX4在A2780-Res细胞中显著下调。RT-PCR结果显示顺铂耐药卵巢癌细胞中NRF2靶基因HO1和NQO1的增加,证明了抗ROS系统活性的增强。以上结果表明,顺铂耐药卵巢癌细胞对Erastin的高敏感性似乎并不依赖于铁死亡防御系统的失活。(2)铁蛋白FTH1在顺铂耐药卵巢癌细胞中下调经Western Blot检测转铁蛋白FTL1及FTH1发现,与亲本细胞相比,SKOV3-Res和A2780-Res细胞中FTH1蛋白水平增加,但FTL1蛋白水平没有增加。Erastin处理后FTH1和FTL1的蛋白表达受到抑制,但顺铂耐药卵巢癌细胞中FTH1的表达水平仍低于其亲本细胞。RT-PCR结果显示,与亲本细胞相比,顺铂耐药细胞中FTH1的m RNA水平没有显著差异。这些数据表明了FTH1受到转录后调节的可能性。(3)FTH1在顺铂耐药卵巢癌细胞中降解增加(1)以10μ/m L CHX处理细胞阻断新蛋白的合成,以未经CHX处理的细胞中FTH1蛋白的表达为起始标准值,发现顺铂耐药卵巢癌细胞中FTH1蛋白的降解率与亲本细胞相比显著增加。(2)在顺铂耐药卵巢癌细胞中恢复FTH1蛋白表达后,顺铂耐药卵巢癌细胞对Erastin诱导的铁死亡敏感性降低。表明顺铂耐药卵巢癌细胞可能通过促进FTH1的降解而增加LIP中游离铁离子的水平,可能是铁死亡敏感性增加的原因。(4)顺铂耐药卵巢癌细胞自噬水平增加(1)通过透射电镜观察了顺铂耐药卵巢癌细胞及亲本细胞的自噬小体情况,发现SKOV3-Res及A2780-Res细胞的自噬小体较对应亲本细胞增加。通过免疫荧光染色检测了顺铂耐药卵巢癌细胞及亲本细胞中自噬标志物LC3b的表达情况,发现SKOV3-Res及A2780-Res细胞的LC3b表达高于对应亲本细胞。说明顺铂耐药卵巢癌细胞维持较高的自噬水平。(2)使用自噬抑制剂3-MA处理后,Western Blot检测FTH1蛋白的表达情况,发现阻断自噬恢复了FTH1的蛋白表达。提示顺铂耐药卵巢癌细胞的高自噬水平导致了FTH1的蛋白降解。(3)3MA处理导致SKOV3-Res和A2780-Res细胞对Erastin杀伤的敏感性降低。上述结果提示,高自噬水平导致的FTH1降解介导了顺铂耐药卵巢癌细胞的铁死亡敏感性。4.顺铂耐药卵巢癌细胞中AKT1缺失介导FTH1自噬降解(1)基于GEO数据库筛查卵巢癌顺铂耐药差异基因通过对GEO数据库GSE23603中17例CR患者和10例IR患者的测序结果进行比对,发现IR患者的测序结果中自噬抑制分子AKT1显著降低。KEGG富集分析表明,CR及IR患者差异基因在MAPK及PI3K-AKT途径中富集。IR患者卵巢癌组织中AKT1表达显著下调。(2)AKT1缺失与卵巢癌预后的关联分析TCGA数据库分析AKT1表达水平与卵巢癌预后的关系,发现AKT1低表达可能预示着较短的生存时间和不良预后。生存分析发现,卵巢癌患者中AKT1的表达缺失与低总生存率、低疾病特异性生存率及更短的无进展间隔有关。这些结果说明,AKT1的丢失是卵巢癌的不良预后因素。(3)AKT1缺失上调顺铂耐药卵巢癌细胞自噬水平在SKOV3-Res和A2780-Res细胞中转导外源性AKT1时,p ULK1降低,LC3b表达增加,表明顺铂耐药细胞通过下调AKT1维持自噬。恢复AKT1表达后耐药卵巢癌细胞中FTH1的表达被挽救。在顺铂耐药的卵巢癌细胞中恢复AKT1表达后,Erastin诱导的细胞铁死亡减少。表明AKT1的丢失可能是顺铂耐药卵巢癌细胞对铁死亡诱导剂高度敏感的原因,这是由p-ULK介导的FTH1自噬降解引起的。结论:1.AKT1的缺失导致顺铂耐药卵巢癌细胞维持高自噬水平;2.AKT1缺失介导的FTH1自噬降解导致顺铂耐药卵巢癌细胞对铁死亡敏感;3.靶向铁死亡可能是逆转卵巢癌顺铂耐药的潜在途径。

近年来,2型糖尿病(Type 2 diabetes mellitus,T2DM)的发病率随着人们生活方式的改变而逐年增加,发病年龄也逐渐低龄化,已成为全世界严重的健康问题。与此同时,生活方式改变引起的血脂代谢紊乱也日益严重。研究发现,脂代谢紊乱可促进T2DM的发生。因此,积极控制脂代谢紊乱可以从一定程度上预防T2DM。胰岛β细胞在调节血糖平衡中起着关键作用,其功能受损是引起糖尿病的重要因素,并且可先于临床确诊T2DM 10余年就开始出现β细胞功能异常。而β细胞功能受损主要体现在β细胞数量的减少和功能的下降。长期以来,人们将其归因于β细胞凋亡,但随着研究的深入,研究者发现β细胞去分化也是导致β细胞功能下降的重要原因。胰岛β细胞在代谢应激的刺激下可发生去分化,虽可暂时逃避凋亡,但同时也失去了胰岛素合成及分泌的能力。因此,预防β细胞去分化或使去分化后的β细胞再分化已成为研究T2DM的新领域。白藜芦醇(Resveratrol,RSV)是一种具有广泛生物活性的天然植物化合物。前期本课题组对RSV在糖脂代谢中的作用进行了深入研究,发现RSV可通过多种机制发挥降脂、降糖、改善胰岛素敏感性的作用。不仅如此,RSV还可以直接作用于胰岛β细胞刺激胰岛素分泌。Jennifer L等发现RSV可预防高脂肪/高糖饮食动物的β细胞去分化,但后续相关研究较少,机制尚不明确。因此,本研究选择正常糖耐量人群通过口服脂肪耐量试验(Oral fat tolerance test,OFTT),按照空腹血脂和餐后血脂分为不同脂代谢状态人群,以明确脂代谢障碍对于胰岛素敏感性及胰岛β细胞功能的影响;然后进一步用高脂饮食诱导的高脂血症金黄地鼠了解脂代谢紊乱对胰岛β细胞功能的影响;最后利用高脂金黄地鼠模型和棕榈酸(Palmitic acid,PA)干预的MIN6细胞模型,探讨RSV是否可通过逆转胰岛β细胞去分化而防止胰岛β细胞功能受损,为RSV调节糖脂代谢提供新的靶点。第一部分不同脂耐量人群血脂与胰岛β细胞功能和胰岛素抵抗相关性的研究目的:本研究通过行OFTT,比较糖耐量正常但脂代谢状态不同的人群胰岛素分泌和胰岛素抵抗的变化,目的在于探讨脂代谢紊乱对胰岛β细胞功能和胰岛素抵抗的影响,为更早期地预防糖尿病的发生提供可能。方法:选取248名口服葡萄糖耐量试验(Oral glucose tolerance test,OGTT)正常的志愿者进行OFTT,根据空腹甘油三酯(Triglycerides,TG)1.7mmol/L及脂餐后4h TG 2.5mmol/L将人群分为三组:(1)脂耐量正常组(Normal fat tolerance,NFT),(2)脂耐量减低组(Impaired fat tolerance,IFT);(3)高甘油三酯血症组(Hypertriglyceridemia,HTG)。比较不同组之间基线及餐后血脂的变化。采用早期胰岛素分泌功能指数(IGI_(30))、Homa-β、葡萄糖处置指数(Disposition index,DI)评价胰岛β细胞功能。采用Homa-IR评估胰岛素抵抗,采用松田胰岛素敏感性指数(ISI_M)评估胰岛素敏感性。将非正态分布的变量ISI_M和DI转换为正态分布的变量Ln ISI_M和Ln DI。采用多元线性回归分析评估血脂与胰岛素抵抗、胰岛素敏感性和β细胞功能之间的相关性。结果:1.三组人群基线数据的比较三组人群的收缩压、舒张压、腰围、BMI、空腹TG、TC、LDL-C、血糖、胰岛素均随脂耐量减低而逐渐升高,而HDL-C随之降低,三组间差异明显。2.三组人群口服脂肪耐量试验餐后血脂变化NFT、IFT、HTG三组人群高脂餐负荷后TG达峰时间逐渐延迟,分别为2h、4h、6h。同时在NFT组及IFT组,TG在10h已降至基线水平;而在HTG组,TG在10h仍未降至基线水平。各时间点的TG及TG的曲线下面积(Area under the curve,AUC)在三组人群中差异明显。而TG的曲线下面积增量(Incremental area under the curve,i AUC)在IFT及HTG两组间无差异。三组人群OFTT期间TC、HDL-C、LDL-C变化幅度不大,且各时间点TC、LDL-C均随脂耐量减低逐渐增高,而HDL-C随之降低。3.三组人群口服葡萄糖耐量试验期间血糖和胰岛素的比较三组人群OGTT期间血糖在不同时间点上随着脂耐量减低而逐渐升高,其中仅糖负荷后1h血糖、AUCglu三组间差异有统计学意义。三组人群胰岛素水平在不同时间点上也随着脂耐量减低而逐渐升高,IFT组及HTG组相较NFT组胰岛素达峰时间延迟,并且三组间仅在空腹及糖负荷后1h及AUCins差异有统计学意义。4.三组人群胰岛素敏感性及胰岛β细胞功能的比较随着脂耐量减低,三组人群的Homa-IR逐渐升高,ISI_M逐渐下降,各组间差异明显。而IGI_(30)在三组间无显著差异,但调整了胰岛素抵抗的混杂因素后DI逐渐下降,三组间各组间差异明显。5.胰岛素敏感性及胰岛β细胞功能的影响因素在多元线性回归分析中,调整了年龄、BMI、0h HDL-C和0h LDL-C后,0h和4h TG分别是Ln ISI_M的独立危险因素。在校正了男性、年龄、有无高血压、BMI和0h HDL-C后,0h和4h TG分别是Ln DI的独立危险因素。小结:1.在葡萄糖耐量正常的个体中,β细胞功能和胰岛素敏感性随着脂耐量的下降而逐渐降低。2.不仅是空腹TG,餐后TG也是β细胞功能受损和胰岛素抵抗的独立危险因素。第二部分高脂饮食对金黄地鼠胰岛细胞和功能的影响及白藜芦醇的干预研究目的:使用高脂饲料喂养金黄地鼠,了解其糖脂代谢情况,并明确其胰岛β细胞的功能状态,给予RSV干预后,验证其是否可以通过逆转胰岛β细胞去分化来改善胰岛β细胞功能。方法:将金黄地鼠随机分为2组,对照组(CON)饲喂普通饲料,高脂组(HF)饲喂高脂饲料,饮食干预12周末评估所有金黄地鼠的糖脂代谢情况。动物模型建立成功后,从HF组随机抽取10只给予RSV以100mg/kg/d灌胃,作为高脂+白藜芦醇组(HF+RSV),而CON组及HF组给予0.9%氯化钠注射液灌胃。整个喂养过程中每周监测体重、进食量,每2周经眼底静脉丛采血用血糖仪检测空腹血糖,留取血清用生化法检测血脂;在前期高脂饮食干预的第12周末及后期RSV药物干预的第12周末,分别行腹腔内注射葡萄糖耐量试验(Intraperitoneal glucose tolerance test,IPGTT)及在体葡萄糖刺激胰岛素分泌试验(Glucose-stimulated insulin secretion,GSIS),通过血糖仪检测不同时间点血糖,同时留取血清以备后期用ELISA法检测胰岛素、胰高血糖素。完成上述相关试验后,处死金黄地鼠,留取血清及胰腺组织。对胰腺组织进行H&E染色、免疫荧光双染色了解胰腺组织形态学变化,并测量胰腺组织中TC、TG含量。最后通过RT-PCR和Western blot检测胰岛β细胞功能及去分化标志物,同时用Western blot检测PI3K/Akt/FOXO1信号通路的关键分子蛋白及磷酸化表达水平。结果:1.高脂饮食喂养12周金黄地鼠的代谢评估HF组的金黄地鼠从高脂喂养第2周开始至第12周结束体重均明显高于CON组。同时,HF组的金黄地鼠TC、TG、HDL-C从高脂喂养的第2周开始,LDL-C从第8周开始,至12周结束均明显高于CON组。在整个高脂饮食喂养的造模过程中,HF组和CON组的空腹血糖无明显差异。但是,在第12周末行IPGTT,可见HF组糖负荷后各时间点血糖、2h AUCglu及2h i AUCglu均较CON组明显升高,存在糖耐量减低。HF组在空腹、高糖负荷后各时间点的胰岛素及2h AUCins、2h i AUCins均较CON组明显升高,提示存在高胰岛素血症。但在GSIS试验中,HF组糖负荷后2min胰岛素及5min i AUCins反而较CON组明显减少,提示HF组金黄地鼠胰岛β细胞第一时相胰岛素分泌功能下降。进一步计算验证了HF组的Homa-IR明显高于CON组,QUICKI、IGI_(30)、DI明显低于CON组。另外,在IPGTT中,虽然空腹胰高血糖素在两组间无明显差异,但是HF组糖负荷后各时间点的胰高血糖素均高于CON组,且HF组2h AUCglucagon也较CON组明显升高,提示HF组金黄地鼠在高糖负荷后胰高血糖素分泌抑制明显受损,引起餐后高胰高血糖素血症,进一步加重糖耐量减低。2.在高脂饮食喂养的基础上,白藜芦醇药物干预12周后金黄地鼠的代谢评估在高脂饮食喂养的基础上,RSV干预后从第7周开始至第12周结束HF+RSV组的体重均明显低于HF组,但仍明显高于CON组。并且HF+RSV组的TC、TG从RSV干预后第4周起,LDL-C从RSV干预后第8周起均明显低于HF组,此差异一直持续至第12周结束。但是HDL-C在整个RSV干预过程中虽HF+RSV组稍低于HF组,但差异无统计学意义。在RSV干预12周末,HF组的游离脂肪酸(Free fatty acid,FFA)较CON组明显升高,而HF+RSV组的FFA较HF组明显下降。另外,在RSV干预过程中,三组间的空腹血糖仍无明显差异。在RSV干预后的第12周末再次行IPGTT,可见HF+RSV组糖负荷后各时间点的血糖及2h AUCglu、2h i AUCglu均明显低于HF组。同时,IPGTT中HF+RSV组空腹及糖负荷后各时间点胰岛素、2h AUCins、2h i AUCins均明显低于HF组。在RSV干预12周后再次行GSIS试验,HF+RSV组糖负荷后2min胰岛素及5min i AUCins均明显高于HF组。进一步计算可知HF+RSV组Homa-IR明显低于HF组,而QUICKI、IGI_(30)、DI明显高于HF组。提示RSV可改善高脂饮食喂养的金黄地鼠胰岛素抵抗,提高胰岛素敏感性,提高胰岛β细胞功能。另外,在IPGTT中,HF+RSV组糖负荷后各时间点胰高血糖素及2h AUCglucagon明显低于HF组。3.白藜芦醇干预可改善高脂诱导的金黄地鼠胰腺组织形态学受损在H&E染色中,CON组金黄地鼠的胰岛边界清楚,细胞核深染,排列整齐,胰岛周围的腺小叶及结缔组织清晰可辨。HF组金黄地鼠的胰岛边界模糊,多数胰岛细胞呈空泡变性,细胞核结构不清,胰岛周围部分腺泡细胞也呈空泡变性。而在HF+RSV组中,胰岛细胞及胰岛周围腺泡细胞的空泡变性明显减轻,细胞核结构也较前清Whole Genome Sequencing晰。在胰岛素-胰高血糖素免疫荧光双染色中,经过定量分析,可知HF组胰岛面积高于CON组及HF+RSV组,但三组间无明显统计学差异。与CON组相比,HF组β细胞量明显增加,但是胰岛中β细胞面积及β细胞相对容积明显下降,α细胞面积、α细胞量及胰岛中α细胞相对容积明显增加,进而导致HF组β细胞与α细胞量的比值明显下降。RSV干预后相较HF组,HF+RSV组中β细胞面积、β细胞相对容积明显增加,α细胞面积、α细胞量及胰岛中α细胞相对容积明显下降,从而导致β细胞与α细胞量的比值明显增加。4.白藜芦醇干预可减少高脂饮食喂养的金黄地鼠的胰腺脂质沉积虽三组金黄地鼠胰腺组织中TC含量无明显差异,但HF组胰腺组织中TG含量较CON组明显升高,而HF+RSV组TG含量较HF组明显下降。5.白藜芦醇干预可改善高脂饮食喂养造成的金黄地鼠胰岛β细胞功能下降及去分化通过RT-PCR检测胰腺组织中胰岛β细胞成熟标志物Pdx-1、Mafa的m RNA水平,及去分化前体细胞标志物Neurogenin3的m RNA水平。与CON组比较,HF组Pdx-1、Mafa的m RNA明显下降,Neurogenin3的m RNA明显升高。HF+RSV组Pdx-1、Mafa的m RNA明显高于HF组,而Neurogenin3明显低于HF组。进一步用Western blot检测Pdx-1、Neurogenin3的蛋白表达情况,其变化趋势与其相应的m RNA水平一致。6.白藜芦醇干预对高脂饮食喂养的金黄地鼠胰腺组织中PI3K/Akt/FOXO1信号通路的影响Western blot检测结果显示,HF组金黄地鼠胰腺组织中p-Akt/Akt、p-FOXO1/FOXO1的蛋白表达相较CON组明显下降,而RSV的干预可明显提高HF+RSV组p-Akt/Akt、p-FOXO1/FOXO1的蛋白表达。小结:1.高脂饮食诱导的脂代谢异常金黄地鼠可表现胰腺组织脂质沉积,导致胰岛β细胞和α细胞功能受损,以及胰岛素抵抗。2.白藜芦醇能改善高脂饮食诱导的金黄地鼠糖脂代谢紊乱、胰岛功能和胰岛素抵抗;逆转高脂诱导的胰岛β细胞去分化,通过调控PI3K/Akt/FOXO1信号通路可能是其实现该作用的机制。第三部分白藜芦醇通过PI3K/Akt/FOXO1信号通路调节棕榈酸诱导的MIN6细胞去分化目的:通过在体外用PA诱导MIN6细胞,在细胞水平上验证RSV是否可通过PI3K/Akt/FOXO1信号通路调节胰岛β细胞的去分化。方法:通过用不同浓度的PA及RSV分别干预并培养MIN6细胞,利用CCK-8法检测各组细胞存活率,从而选取最终合适的PA造模浓度及RSV干预浓度。用0.3mmol/L PA孵育MIN6细胞24h后,再用10μmol/L RSV联合干预24h后行油红O染色。进一步联合PI3K抑制剂LY29400210μmol/L进行干预,最终分为5组:对照组(CON)、棕榈酸组(PA)、棕榈酸+白藜芦醇组(PA+RSV)、棕榈酸+白藜芦醇+PI3K抑制剂组(PA+RSV+LY)、棕榈酸+PI3K抑制剂组(PA+LY)。对上述五组进行GSIS试验,用ELISA法检测各组在GSIS试验中的胰岛素。最后通过RT-PCR和免疫荧光染色检测胰岛β细胞功能及去分化标志物,并用Western blot法检测PI3K/Akt/FOXO1信号通路的关键分子蛋白及磷酸化表达水平。结果:1.确定棕榈酸造模浓度及白藜芦醇的药物干预浓度首先分别用不同浓度的PA干预MIN6细胞,通过CCK-8法检测MIN6细胞的存活率,同时结合PA干预后MIN6细胞的镜下表现,最终选择0.3mmol/L作为后续试验中PA诱导MIN6细胞建立脂毒性模型的干预浓度。然后再用不同浓度的RSV分别干预MIN6细胞及PA干预的MIN6细胞,通过CCK-8法检测细胞的存活率。在PA干预的基础上,RSV10μmol/L可使细胞存活率较PA组显著增加,故最终选择10μmol/L作为RSV药物干预浓度。2.白藜芦醇干预可改善棕榈酸诱导MIN6细胞的镜下形态在PA干预的基础上,联合RSV处理后PA+RSV组MK-4827 IC50细胞镜下形态较PA组明显改善,漂浮及脱落细胞减少,细胞形态趋于正常,大部分细胞重新长出长尾和角。3.白藜芦醇干预可减轻棕榈酸诱导MIN6细胞的脂质沉积油红O染色可见,相较于CON组,PA组MIN6细胞胞浆内可见大量橘红色的脂滴,而PA+RSV组细胞胞浆中橘红色脂滴明显减少。4.白藜芦醇干预可改善棕榈酸诱导MIN6细胞的胰岛素分泌受损在GSIS试验中,在2.8mmol葡萄糖溶液的孵育下,PA组、PA+RSV组、PA+RSV+LY组、PA+LY组均较CON组胰岛素明显增加;而在16.7mmol/L葡萄糖溶液的刺激下,PA组的胰岛素较CON组明显下降,而PA+RSV组的胰岛素较PA组明显增加,但加入PI3K抑制剂LY294002后,则PA+RSV+LY组胰岛素又回到PA组水平,两组间差异无统计学意义。5.白藜芦醇干预可改善棕榈酸诱导MIN6细胞的去分化用RT-PCR检测各组MIN6细胞成熟胰岛β细胞特异性标志物Pdx-1、Mafa及去分化前体细胞标志物Neurogenin3的m RNA的表达情况。PA组Pdx-1、Mafa的m RNA表达较CON组明显下降,而Neurogenin3的m RNA表达明显增加,PA+RSV组的Pdx-1、Mafa m RNA的表达较PA组明显增加,而Neurogenin3的表达较PA组明显降低。但是加入PI3K抑制剂LY294002,则逆转了RSV的上述作用,使上述分子的m RNA的表达水平又回到PA组的水平。用免疫荧光染色检测各组MIN6细胞的胰岛素INS、Pdx1、Neurogenin3的表达。结果显示,相对于CON组,PA组的INS、Pdx-1的表达明显减少,而Neurogenin3的表达明显增加。而相较于PA组,PA+RSV组的INS、Pdx-1表达明显增加,而Neurogenin3的表达明显减少。但是加入PI3K抑制剂LY294002,PA+RSV+LY组的INS、Pdx-1、Neurogenin3的表达则基本回到PA组的表达水平。6.白藜芦醇改善棕榈酸诱导MIN6细胞去分化是通过调节PI3K/Akt/FOXO1信号通路与CON组相比,PA组p-Akt/Akt及p-FOXO1/FOXO1的蛋白表达明显下降。而与PA组相比,PA+RSV组p-Akt/Akt、p-FImidazole ketone erastin molecular weightOXO1/FOXO1蛋白表达明显升高,加入LY294002后,PA+RSV+LY组的p-Akt/Akt、p-FOXO1/FOXO1的蛋白表达水平又降至PA组水平。且p-Akt/Akt、p-FOXO1/FOXO1在各组中的表达水平,与GSIS试验中各组胰岛素分泌水平相对应,进一步证明RSV是通过激活PI3K/Akt/FOXO1信号通路改善PA诱导的MIN6细胞去分化,从而提高胰岛β细胞的胰岛素分泌功能。通过对各组MIN6细胞进行FOXO1的免疫荧光染色发现,RSV在增加FOXO1磷酸化的基础上,可抑制PA诱导的FOXO1核异位及积累,使FOXO1更多的在细胞浆中表达,而同时加入PI3K抑制剂LY294002后,可再次抑制FOXO1磷酸化,使更多的FOXO1易位到细胞核内集聚。小结:白藜芦醇可通过激活PI3K/Akt/FOXO1信号通路,抑制FOXO1的核聚集,而发挥逆转PA诱导的胰岛β细胞去分化的作用。结论:1.空腹和餐后TG升高均是β细胞功能受损和胰岛素抵抗的独立危险因素。2.高脂饮食诱导的脂代谢异常金黄地鼠可表现胰腺组织脂质沉积,导致胰岛β细胞和α细胞功能受损,以及胰岛素抵抗。3.白藜芦醇能改善高脂饮食诱导的金黄地鼠糖脂代谢紊乱、胰岛功能和胰岛素抵抗;可逆转高脂诱导的胰岛β细胞去分化,通过调控PI3K/Akt/FOXO1信号通路是其实现这一调节的机制之一。

目的：观察双极射频消融术联合人工瓣膜置换术治疗重症心脏瓣膜病合并房颤患者的效果。方法：选取2019年3月至2021年3月该院收治的98例重症心脏瓣膜病合并房颤患者进行前瞻性研究，按照随机数字表法分为观察组与对照组各49例。对照组采用人工瓣膜置换术治疗，观察Human genetics组在对照组基础上联合双极射频消融术治疗，比较两组手术相关指标（手术时间、术中出血量）水平、入住ICU时间、住院时间、心功能指标[左心房内径（LAD）、右心房内径（RAD）、左心室射血分数（LVEF）、左心室缩短分数（LVFS）]水平和并发症发生率。结果：观察组手术时间长于对照组，入住ICU时间和住院时间均短于对照组，差异有统计学意义（P<0.05）；术后3、6个月，观察组LAD、RAD水平低于对照组，LVEF、LVFS水平高于对照组，差异有统计学意义（P<0.05）；两组术中出血量和并发症发生率比较，差异无统计学意义（P>0.05）。结论：双极射频消融术RP56976体内联合人工瓣膜置换术治疗重症心脏瓣膜病合并房颤患者可缩短入住ICU时间和住院时间，改善心功能指标水平，效果优于单纯人NVP-TNKS656研究购买工瓣膜置换术治疗，但会延长手术时间。

目的 探究血管紧张素Ⅱ在巨噬细胞（macrophage, M_φ）衰老过程中的作用及其潜在的机制。方法 Western blot分别检测血管紧张素Ⅱ处理RAW264.7后衰老相关蛋白p16、p21表达，信号分子JAK2、STAT3表达，磷酸化分子p-JAK2、p-STAT3蛋白表达以及CXCL4的表达；CXCL4处理RAW264.7后衰老相关蛋白p16、p21的表达；JAK2/STAT3磷酸化抑制剂预处理后CXCL4蛋白表达。qRT-PCR与Western blot检测siCXCL4处理RAW264.7后p16、p21以及CXCL4的表达；β-半乳糖苷酶染色检测RAW264.7衰老。结果 血管紧张素Ⅱ处理RAW264.7后衰老相关蛋selleck白p16、p21以及CXCL4表达明显增加；血管紧张素Ⅱ上调M_φ中p-JAK2、Temple medicinep-STAT3磷酸化水平。JAK2/STAT3磷酸化抑制剂处理后RAW264.7中CXCL4表达下调；CXCL4处理RAW264.7后衰老相关蛋白p16、p21表达增加；RAW264.7细胞系中敲除CXCL4后衰老蛋白p16、p21表达减低，β-半乳糖苷酶染色显示RAW264.7衰老缓解。结论 血管紧张素II通过激活JAK2/STAT3信号上调CXCL4表达促进RAW264.7衰老更多的发展进程。

目的:探讨岩黄连总碱对牙龈卟啉单胞菌脂多糖(Pg-LPS)诱导的人牙龈成纤维细胞增殖与凋亡的影响及其可能作用机制。方法:体外培养人牙龈成纤维细胞，分为对照组(NC组)、PZD1839g-LPS组、5μg/ml岩黄连总碱+Pg-LPS组、10μg/ml岩黄连总碱+Pg-LPS组、20μg/ml岩黄连总碱+Pg-LPS组、miR-NC+Pg-LPS组、miR-223+Pg-LPS组、anti-miR-NC+Pg-LPS组、anti-miR-223+Pg-LPS组、20μlocal infectiong/ml岩黄连总碱+Pg-LPS+miR-NC组、20μg/ml岩黄连总碱+Pg-LPS+miR-223组。采用EDU、流式细胞术分别检测细胞增殖与凋亡；RT-qPCR法检测miR-223的表达量；ELISA法检测白细胞介素-1β(IL-1β)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)水平；Wwww.selleck.cn/products/pexidartinib-plx3397estern blot检测剪切的半胱天冬氨酸蛋白酶3(Cleaved-caspase-3)、pro-caspase-3、磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(AKT)蛋白表达。结果:岩黄连总碱(5、10、20μg/ml)和下调miR-223表达可显著升高Pg-LPS诱导的人牙龈成纤维细胞增殖活力和pro-caspase-3蛋白表达水平，降低细胞凋亡率、IL-1β和TNF-α水平以及Cleaved-caspase-3、p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT蛋白表达水平(均P<0.05)。过表达miR-223可逆转岩黄连总碱对Pg-LPS诱导的人牙龈成纤维细胞增殖、凋亡及PI3K/AKT通路的作用。结论:岩黄连总碱可通过下调miR-223表达而抑制PI3K/AKT信号通路从而促进Pg-LPS诱导的人牙龈成纤维细胞增殖，并抑制细胞凋亡和炎性反应。

目的 建立分泌抗-PP1P~k(又称抗-Tj~a)的淋巴母细胞Fulvestrant溶解度样细胞系(lymphoblastoid cell line, LCL)和单克隆杂交瘤细胞株。方法 无菌条件下常规方法制备p[Tj(a-)]血型献血者外周血单个核细胞(Peripheral blood mononuclear cells, PBMC),用EB病毒(Epstein-Barr virus, EBV)转化单个核细胞中的B淋巴细胞，使其增殖形成B淋巴母细胞样细胞克隆。用菠萝酶处理的正常AB型和O型红细胞以及p[Tj(aHistone Methyltransf抑制剂-)]红细胞筛选培养上清，通过显微吸引分离技术获得分泌特异性抗-PP1P~k的LCL,与SHM-D33骨髓瘤细胞进行融合。异源杂交瘤细胞经次黄嘌呤(H)-氨基蝶呤(A)-胸腺嘧啶(T)-脱氧胞嘧啶核苷(D)-毒毛旋花苷(O)即HOTD培养基选择性培养、抗体筛选以及有限稀释亚克隆，建立分泌特异性抗体的单克隆杂交瘤细胞株。结果 从O型p[Tj(a-)]献血者外周血B淋巴细胞EBV转化Probiotic product细胞培养上清中，初筛得到与正常红细胞全部凝集，与p[Tj(a-)]红细胞不凝集的单个淋巴母细胞样克隆5E1-E5,初步鉴定培养上清具有抗-PP1P~k特异性。随后利用杂交瘤技术，将5E1-E5细胞与SHM-D33骨髓瘤细胞进行融合，建立了持续稳定分泌IgM抗-PP1P~k的单克隆杂交瘤细胞株。结论 本研究通过EBV转化和杂交瘤技术建立了分泌抗-PP1P~k的人单克隆细胞株，这项工作使大规模筛选稀有p[Tj(a-)]血型成为可能，对我国稀有血型库的建设具有重要意义。

目的 探讨经方葶苈大枣泻肺汤对心肌梗死后心力衰竭模型大鼠心室重构的作用机制。方法 应用左冠状动脉前降支结扎术构建心肌梗死后心力衰竭大鼠模型,分8https://www.selleck.cn/products/r428.html组:假手术组、模型组、A779组(1 mg/kg)、A779(1 mg/kg)+葶苈大枣泻肺汤等效剂量组(0.8 g/kg)、A779(1 mg/kg)+葶苈大枣泻肺汤高剂量组(1.6 g/kg)、葶苈大枣泻肺汤等效剂量组(0.8 g/kg)、葶苈大枣泻肺汤高剂量组(1.6 g/kg)和氯沙坦钾组(10 mg/kg),各组分别给予等体积蒸馏水或者相应的药物,灌胃4周。采用Masson染色法测定大鼠心肌组织中胶原纤维分布;采用碱水解法测定心肌组织羟脯氨酸(Hyp)含量;采用免疫组化法检测心肌组织中Ⅰ型胶原蛋白(COLⅠ)、Ⅲ型胶原蛋白(COLⅢ)的表达水平;采用酶联免疫吸附测定法检测大鼠血清中基质金属蛋白酶2(MMP-2)、MMP-9、金属蛋白酶组织抑制因子1(TIMinfection fatality ratioP-1)、可溶性致瘤性抑制因子2(sST-2)等心肌纤维化相关指标;采用Western blot法检测心肌组织中血管紧张素转换酶2-血管紧张素-(1-7)-Mas[ACE2-Ang-(1-7)-Mas]轴相关蛋白的表达。结果 与假手术组比较,模型组、A779组心肌细胞排列紊乱,胶原纤维沉积明显增多,心肌纤维化明显,Hyp含量和MMP-2、MMP-9、sST-2水平显著升高,COLⅠ、COLⅢ阳性表达显著增强,TIMP-1水平和ACE2、Ang-(1-7)、Mas蛋白表达水平显著降低(P<0.05)。与模型组更多比较,葶苈大枣泻肺汤等效剂量组和高剂量组上述指标均可得到不同程度的改善。与A779组比较,A779+葶苈大枣泻肺汤等效剂量组及A779+高剂量组心肌排列及胶原分布可一定程度地改善,Hyp含量和MMP-2、MMP-9水平降低,COLⅠ、COLⅢ阳性表达显著减少(P<0.05),但Ang-(1-7)和Mas蛋白表达水平未显著升高。结论 葶苈大枣泻肺汤可通过提高ACE2-Ang-(1-7)-Mas轴蛋白的表达改善心肌梗死后心力衰竭模型大鼠的心室重构。

目的 探讨靶向PD-1基因的miRNA210对胆囊癌细胞增殖、凋亡的影响。方法 电转染法将PD-1过表达PCDNA3.1载体转染至人胆囊癌GBC购买BMN 673-SD细胞，CCK-8法、流式细胞仪检测细胞增殖、凋亡；miRNA Microarray分析miRNA表达谱变化。利用Lipofectamine~(TM)2000将miRNA210-mimic转染至GBC-SD细胞，双荧光报告基因验证PD-1是miRNA210的靶基因，CCK-8法、流式细胞仪检测miRNA210转染后细胞增殖、凋亡变化。结果 PD-1转染后，细胞增殖活性升高，细胞凋亡购买PD0325901率降低(F=25.90,P<0.0001);人GBC-SD细胞miRNA表达谱发生明显变化，其中上调miRNAs 33个，下调miRNGroundwater remediationA 22个，其中miRNA210表达差异最显著。miRNA210转染后，转染组荧光素酶活性降低(F=43.51,P<0.0001),细胞增殖活性降低(0.15±0.17)(F=4.134,P=0.0431),细胞凋亡率升高(F=47.83,P<0.0001)。结论 miRNA210通过靶向下调PD-1基因表达，抑制GBC-SD细胞增殖，促进细胞凋亡，可能参与胆囊癌的发生发展过程。

三阴性乳腺癌是乳腺癌中一类预后较差的亚型,目前尚无有效的治疗靶点。G蛋白偶联雌激素受体(GPER)作为一种新型雌激素受体,可以介导三阴性乳腺癌(TNBC)细胞的雌激素作用,促进肿瘤的恶性进展及药物耐药。然而,GPER在肿瘤相关成纤维细R428采购胞(CAFs)中的作用尚不清楚,而同时CAFs又是肿瘤微环境中的主要细胞成分。本研究将探索GPER在三阴性乳腺癌中通过调控肿瘤微环境影响三阴性乳腺癌进展及免疫逃逸的分子机制。第一部分:晚期三阴性乳腺癌微环境CAFs中GPER的表达及其临床意义目的:探索乳腺癌微环境中CAFs上GPER的表达情况及其与PD-L1表达、临床病理变量间的相关性。方法:应用免疫组织化学检测91例已接受PD-1/PD-L1抑制剂免疫治疗的TNBC患者组织标本。分析这些组织中肿瘤间质GPER、肿瘤实质GPER及肿瘤实质PD-L1表达情况及其之间的相关性。将GPER的表达与患者的临床信息结合,使用Kaplan-Meier分析肿瘤实质GPER、肿瘤间质GPER表达高低与患者接受PD-1/PD-L1抑制剂治疗后无疾病进展生存时间(PFS)的关系。使用单因素及多因素Cox回归探索患者接受PD-1/PD-L1抑制剂之后PFS的影响因素。结果:(1)GPER在肿瘤间质表达高低与肿瘤大小(T)、区域淋巴结转移(N)、病理分期显著相关(p<0.05);与患者年龄、月经状态、肿块部位及组织学分级无明显统计学相关性(p>0.05);(2)GPER在肿瘤实质中表达高低与年龄、肿瘤大小(T)、区域淋巴结转移(N)、病理分期、月经状态、组织学分级及肿块部位无明显统计学相关性(p>0.05);(3)通过Spearman相关性分析,发现肿瘤间质GPER表达与肿瘤实质PD-L1表达呈正相关(p<0.001,R=0.724);肿瘤实质GPER表达与肿瘤实质PD-L1表达呈正相关,但是统计学无意义(p=0.074,R=0.188);4)以间质GPER IHC评分将患者分高低两组,两组患者的中位PFS有明显统计学(p<0.001),两组患者中位PFS时间相距120天(145天vs.265天);而以实质GPER IHC评分将患者分高低两组时,两组患者的PFS无明显统计学(p=0.675),两组患者中位无进展生存时间差异80天(225天vs.145天);5)GPER间质表达水平是晚期三阴性乳腺癌患者接受PD-1/PD-L1抑制剂治疗后,影响患者PFS的独立危险因素。结论:GPER肿瘤间质表达高低是晚期三阴性乳腺癌患者接受PD-1/PD-L1抑制剂治疗后PFS的独立危险因素。第二部分:细胞质GPER介导肿瘤相关成纤维细胞与肿瘤细胞相交互并促进乳腺癌进展的分子机制目的:探索肿瘤相关成纤维细胞(CAFs)中GPER调控三阴性乳腺癌(TNBC)增殖、凋亡及侵袭的分子机制方法:使用TNBC细胞与CAFs细胞共培养系统,通过E2及G15等药物激活或抑制CAFs中GPER的功能。使用免疫印迹法检测信号通路轴中相关蛋白改变情况,使用CCK-8、流式细胞术及侵袭实验检测TNBC细胞增殖、凋亡及侵袭情况。相关试剂盒检测葡萄糖消耗量、乳酸、丙酮酸、谷氨酰胺、ATP、乙酰辅酶A、琥珀酸生成量。使用染色质免疫共沉淀(Ch IP)实验检测GLUL转录因子结合情况。原位异种移植瘤实验和肺转移瘤实验检测在体外模型中,CAFs上GPER对TNBC的生物学效应。结果:(1)E2(GPER激活剂)激活CAFs细胞质GPER时,细胞内和细胞外培养基谷氨酰胺的产生都会增加,而当同时加用G15(GPER拮抗剂)时谷氨酰胺的产生会受到抑制;在激活细胞质GPER的CAFs中敲低GLUL,细胞内和条件培养基中的谷氨酰胺减少;(2)E2激活CAFs细胞质GPER时,BT-549和MDA-MB-231的S期占比、细胞增殖、细胞侵袭和表柔比星耐药性增强,细胞凋亡减少;同时,当敲除GLUL或在E2刺激CAFs同时使用G15处理,以上表型会得以回复;(3)随着激活CAFs细胞质中GPER,c AMP、磷酸化PKA、磷酸化CREB和GLUL表达增加;而同时使用G15时,这些分子的改变得以回复。Ch IP试验证实CREB可以结合GLUL启动子。GPER或CREB的敲低显著降低CAFs和条件培养基中谷氨酰胺的产生;(4)体内实验证实:与注射MDA-MB-231和对照CAFs混合肿瘤负荷小鼠相比,注射MDA-MB-231和CAFs(CAFs/sh GPER、CAFs/sh GLUL、CAFs/sh GPER+sh GLUL)的小鼠肿瘤较小、生长较慢及肺转移瘤数目更少。结论:雌激素E2激活CAFs细胞质GPER/c AMP/PKA/CREB信号通路轴,进而增强GLUL的表达,促进谷氨酰胺的合成和分泌,进一步调控癌细胞增殖、凋亡及侵袭。第三部分:肿瘤微环境中CAFs中GPER通过分泌谷氨酰胺调控三阴性乳腺癌免疫逃逸分子机制目的:探索肿瘤相关成纤维细胞(CAFs)中GPER调控三阴性乳腺癌(TNBC)免疫逃逸的分子机制。方法:使用三阴性乳腺癌细胞与CAFs细胞及乳腺癌细胞与Jurkat T共培养系统,通过E2、G1及G15等药物刺激CAFs中GPER的功能;通过细胞免疫荧光及免疫印迹法检测三阴性乳腺癌细胞中PD-L1表达及相关信号通路激活情况;通过乳腺癌细胞杀伤实验及流式细胞仪检测TNBC细胞凋亡情况。结果:(1)当含有E2或G1的条件培养基(CM)刺激CAFs细胞后的上清液,处理BT-549和MDA-MB-231后,肿瘤细胞上PD-L1表达升高;当在E2刺激CAFs的同时加用G15处理,肿瘤细胞上的PD-L1表达下降;(2)当含有E2或G1的CM刺激CAFs细oral oncolytic胞后的上清液,处理BT-549和MDA-MB-231后,肿瘤细胞内磷酸化EGFR(p EGFR)、磷酸化ERK(p-ERK)、磷酸化c-Jun(p-c-JUN)和PD-L1表达增加;当使用E2与G15共同处理CAFs时,以上蛋白变化得以回复;当使用含有E2的CM刺激CAFs的细胞培养上清液处理与Jurkat T共培养的MDA-MB-231和BT-549时,肿瘤细胞存活量更多,凋亡更少。而使用含有E2+G15的CM刺激CAFs的细胞培养上清液处理与Jurkat T共培养的MDA-MB-231和BT-549细胞存活量下降,凋亡更多;(3)当含有E2的CM刺激CAFs细胞后的上清液处理BT-549和MDA-MB-231,细胞内相关通路磷酸化蛋白及PD-L1表达升高。此时,与Jurkat T共培养的肿瘤细胞存活量更多,凋亡更少。相反地,当在E2刺激CAFs中同时使用sh ASCT2(谷氨酰胺转运体)处理肿瘤细胞时,BT-549和MDA-MB-231上相关通路蛋白磷酸化及PD-L1表达下降,与Jurkat T共培养的肿瘤细胞存活量更少,凋亡更多;(4)当含有E2的CM刺激CAFs细胞后的上清液处理BT-549和MDA-MB-231,乳腺癌细胞内相关通路蛋白磷酸化及PD-L1表达升高。此时,与Jurkat T共培养的肿瘤细胞存活量更多,凋亡更少。当在E2刺激CAFs中同时使用AG126(ERK1/2磷酸化抑制剂,25μM)处理肿瘤细胞时,BT-549和MDA-MB-231上相关通路磷酸化蛋白及PD-L1表达下降,与Jurkat T共培养的肿瘤细胞存活量更少,凋亡更多。结论:雌激素激活CAFs细胞质中GPER改变肿瘤微环境中的谷氨酰胺,三阴性乳腺癌细胞通过ASCT2转运微环境中的谷氨酰胺至细胞内,激活细胞内的EGFR/ERK/c-Jun信号通路,从而改变自身PD-L1的表达,进而影响Jurkat 确认细节T细胞对三阴性乳腺癌的免疫杀伤。