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【研究背景】登革病毒((Dengue virus,DENV)是一种节肢动物传播的单股正链RNA病毒,可引起登革热、登革出血热和登革休克综合征。DENV已成为全球健康威胁,世界上约有一半的人口面临感染风险。虽然DENV引起的疾病有一定程度的自限性,但抗体依赖增强(Antibody dependent enhancement,ADE)效应增加了第二次感染异型病毒后的重症率和死亡率。由于没有针对登革病毒的特效治疗药物,因此迫切需要开发安全有效的疫苗来预防感染和疾病进展。目前,只有一种减毒活疫苗(Cy D-TDV)在一些国家获得了临床使用许可,但Cy D-TDV的临床试验表明,其只对既往感染登革热病毒的血清阳性者是有效和安全的。而对第一次接种疫苗的血清阴性者会增加患严重登革热的风险。所以对疫苗的研究和持续开发仍是预防登革病毒感染的有效措施。多肽疫苗可以激发表位特异性抗体和免疫反应,从而消除与疫苗相关的不良反应的风险。同时将多肽疫苗其连接到纳米颗粒上进行递送可以有效的提升免疫原性和代谢稳定性。球形核酸作为一种新兴的纳米材料,可作为多肽或蛋购买Taurine白质输送的载体。在抗病毒研究中,球形核酸不但可以附载相应的抗原表位,而且其表面吸附核酸通常由免疫刺激核酸形成,大大提高了机体的免疫反应。基于球形核酸载体的登革多肽疫苗有望成为预防登革病毒感染的候选疫苗。【研究目的】目前登革疫苗的安全性和有效性在临床上并不令人满意,这就需要一种新的方法来设计更加安全有效的登革疫苗。本研究通过对DENV的四种血清型基因检测,筛选出一组针对登革四种血清型的共有抗原表位,据此设计一种基于球形核酸载体的登革多肽疫苗。以期得到一种具有较好抗原递呈能力、较高安全性及较高免疫效应水平的登革多肽疫苗。【研究方法】(1)多肽疫苗的构建利用紫外分光光度法检测粒径30 nm的Au NP与巯基化的寡核苷酸序列(CSV-1A)是否偶联成功形成球形核酸结构;通过琼脂糖凝胶电泳试验检测含有半胱氨酸的多肽与巯基化的Cp G偶联效果;通过透射电镜,粒径和Zeta电位检测多肽疫苗的形貌、大小及所带电性。(2)骨髓样树突状细胞(BMDCs)最佳培养条件的筛选将BMDCs在含有不同浓度生长因子的培养液中培养,通过免疫荧光试验(immunofluorescence,IF)对BMDCs表面标志物CD11c的表达量进行检测,筛选出最优培养浓度。(3)BMDCs对多肽疫苗的摄取及诱导其成熟的情况通过激光共聚焦显微镜和流式细胞术检测BMDCs细胞对多肽抗原的摄取能力进行定性和确认细节定量分析;通过RT-q PCR实验方法在分子水平检测BMDCs表面共刺激分子CD80和CD86的表达情况;通过流式细胞术检测BMDCs表面共刺激分子CD80和CD86的蛋白表达情况;通过酶联免疫吸附试验(Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)检测BMDCs培养上清中细胞因子IL-12p70的分泌情况。(4)免疫效应及体内安全性评价通过ELISA检测多肽疫苗免疫小鼠后特异性抗体Ig G水平;通过观察各个器官的病理切片检测多肽疫苗在小鼠体内的生物安全性。【研究结果】(1)本研究构建了一种基于球形核酸载体的登革多肽疫苗(SNA-TBB)。该球形核酸递送载体以Au NP为球形核酸的核心,CSV-1A为附着于核心表面的核酸。将含有半胱氨酸的多肽TBB与巯基化的Cp G通过二硫键偶联,CSV-1A与Cp G通过碱基互补配对的方式,将多肽与球形核酸进行偶联。表征分析结果显示,SNA-TBB粒径在50 nm左右,呈表面光滑的球形,并且具有较好的分散性。(2)比较BMDCs在添加不同浓度生长因子培养基中的生长及CD11c的表达情况,筛选出当GM-CSF为10 ng/ml,IL-4为20 ng/ml时,BMDCs的生长情况及CD11c的表达最优;基于球形核酸载体的多肽疫苗对BMDCs不产生细胞毒性,并且能有效地递呈抗原。SNA-TBB在分子水平及蛋白水平均能有效刺激Multiplex ImmunoassaysBMDCs表面共刺激分子CD80和CD86的表达,也能促进BMDCs分泌IL-12p70。(3)SNA-TBB免疫小鼠后能诱导产生高水平的抗原特异性Ig G抗体,并且通过对免疫后小鼠的心、脾、肺、肾的病例切片观察发现,各脏器未见异常细胞死亡、组织反应或炎症浸润。综上所述,我们构建了一种良好的多肽疫苗递送系统,可有效地促进BMDCs的成熟及活化,诱导产生较高的抗原特异性Ig G抗体,并且具有较好的体内外安全性。【研究意义】本研究成功构建了一种基于球形核酸载体的递送系统,该递送系统可有效地将抗原递呈至BMDCs,刺激BMDCs成熟及活化。有效解决了多肽疫苗免疫原性差的问题,同时表现出良好的生物安全性。多肽疫苗作为一种新兴的第三代疫苗技术,为研究安全有效的登革疫苗提供了新的研究思路及方向。

芥酸是可再生的重要精细化工原料,目前,植物油是芥酸的重要来源,油菜又是全球重要的经济与油料作物,而芥酸的含medical specialist量将影响油菜的品质和用途。植物芥酸是在以FAE1(Fatty acid elongase 1)编码的β-酮脂酰-Co A合酶为关键限速酶的多酶复合体的催化下合成的,b ZIP(Basic leucine zipper,b ZIP)转录因子脱落酸不敏感5(Abscisic acid-insensitive 5,ABI5)在脱落酸(AbscisicPanobinostat分子量 Acid,ABA)介导的信号通路中起关键作用,中介体亚基Mediator25(MED25)在转录过程的多个步骤起到重要的作用。已有研究表明外源ABA对油菜种子的芥酸含量有影响,但ABI5是否参与芥酸合成及具体的调控机制尚不清楚同时MED25是否通过与ABI5互作参与调控芥酸合成未见报道。本文关注研究调控种子生长发育重要的转录因子ABI5,将其进行功能分析,探究ABI5在芥酸合成途径中起到的作用和机制以及验证MED25是否通过ABI5参与芥酸合成,从而为深入探究ABA信号通路调控芥酸合成的机制,以及为改良油菜品质提供一些新的思路。因此,为了证实ABI5对芥酸合成的调控机制,本研究得到了以下实验结果:1.从“中油821”中克隆出BnABI5片段,c DNA总全长为1321bp,编码一个包含437个氨基酸的蛋白,蛋白序列第349到413的氨基酸含有b ZIP家族典型的BRLZ结构域(BRLZ,Basic region leucin zipper),说明BnABI5是属于碱性亮氨酸拉链类型的转录因子。亚细胞定位预测结果表明BnABI5蛋白定位于细胞核中。将携带BnABI5的亚细胞定位重组质粒1302-BnABI5-GFP以及Marker共转入GV3101,注射法转化烟草下表皮细胞,荧光显微镜观察到的绿色荧光表明BnABI5蛋白与Marker共定位于细胞核中。2.从“中油821”中克隆得到BnFAE1启动子共1310bp,序列中含有TATAbox和CAAT-box等基本的核心启动子元件,植物激素、生长发育和逆境等的重要元件以及与BnABI5结合的G-box和G-box-like序列等,根据序列分析和结合位点预测将BnFAE1启动子分为3段。3.构建BnABI5启动子和的BnFAE1启动子GUS表达载体,转化野生型拟南芥,获得1301-p BnABI5-GUS和1301-p BnFAE1-GUS转基因拟南芥各两个株系,对T3代转基因拟南芥进行GUS活性分析,结果表明BnABI5启动子和BnFAE1启动子分别能够驱动GUS报告基因的表达,BnABI5基因在拟南芥的根、茎、叶脉、叶柄、花、果荚和种子中均有活性;BnFAE1在种子中表现出有活性,而在幼苗期叶柄和叶片交界处也有表达。4.酵母单杂交和双荧光素酶实验证明BnABI5转录因子能与BnFAE1基因启动子全长以及截短体P2和P3结合。构建BnABI5过表达载体,转化野生型拟南芥,获得1302-BnABI5-GFP转基因拟南芥的两个株系,对T3代转基因拟南芥进行At FAE1基因表达量检测和芥酸含量测定,结果表明BnABI5正调控调控At FAE1基因表达并且促进芥酸合成。5.以“中油821”的果荚c DNA为模板GNE-140半抑制浓度克隆出MED25片段,c DNA全长2437bp,并编码一个含有811个氨基酸的蛋白。酵母双杂、双分子荧光互补可知BnABI5转录因子能与中介体亚基BnMED25相互作用。再综合双荧光素酶结果可知BnMED25参与调控BnABI5的表达进而影响芥酸的合成。

【目的】传统的油茶育种工作效率低、周期长，分子标记辅助育种已成为推动油茶遗传改良的必要方法，selleck Erdafitinib对油茶基因组SSR位点进行整体统计分析，为提高油茶的选育效果、缩短选育周期提供了一条有效途径。通过对四倍体油茶基因组SSR位点进行搜索，统计分析其基因组SSR序列的分布模式及特征，获得优质、有价值的SSR分子标记位点，为进一步开展油茶品种的遗传分析、分子标记辅助育种、指纹鉴定等研究工作提供便利条件。【方法】本研究基于已获得的四倍体油茶全基因组数据，使用MISA软件全面搜索基因组中1～6核苷酸各重复类型的SSR位点，统计分析其分布模式及特征，通过Primer3.0软件进行批量SSR引物设计。【结果】在全长为11 069 152 038 bp的四倍体油茶全基因组中共搜索到不同类型SSR位点6 254 681个，一共鉴定出463个不同重复基元，平均1.77 kb出现一个SSR位点；出现频率最高的是单核苷酸重复类型SSR位点，占比62.08%，六核苷酸重复类型SSR位点数量最少，仅占比0.46%；在四倍体油茶基因组SSR序列中A、T碱基占据绝对优势，而G、C含量较少，具有碱基偏好性。四倍体油茶基因组各类型SSR序列的整体长度区间为10～187 bp，平均长度15.57 bp；除单核苷更多酸重复类型，长度medical libraries≥20 bp的SSR序列占全部SSR序列的15.75%，其中二、三、四核苷酸三种重复类型SSR长度变异程度显著高于五、六核苷酸重复类型，因此，二、三、四核苷酸重复类型为设计SSR引物的主要标记来源；基于四倍体油茶基因组SSR位点数据，共开发引物1 358 248对。【结论】本研究首次对四倍体油茶全基因组中SSR位点的分布模式与特征进行整体统计分析，并批量开发SSR引物，为油茶分子标记辅助育种提供参考。

多聚免疫球蛋白受体(Polymeric immunoglobulin receptor,PIGR)是多聚免疫球蛋白(Polymeric immunoglobulin,PIG)的特异性受体。研究报道PIGR能够发挥抗病毒和抗菌的功能。本研究中,我们发现了一种含有富含半胱氨酸清道夫受体(Scselleck化学avenger receptor cysteine-rich,SRCR)结构域的新型多聚免疫球蛋白受体,将其命名为SIGR,并探究其在抗菌免疫中发挥的功能。SIGR含有一个SRCR结构域,两个IG结构域。SIGR在所检测斑马鱼的正常组织中都有表达。嗜水气单胞杆菌(Aeromonas hydrophila)刺激后,在检测组织中SIGR的表达量均发生了显著性的上调,推测SIGR可能参与斑马鱼的抗菌免疫反应。体外表达纯化了SIGR重组蛋白,进行细菌结合和凝集实验发现,SIGR可以结合细菌使细菌发生凝集。通过构建截短结构域蛋白SIGR-SRCR、SIGR-IG,对二者进行细菌结合和凝集实验selleck NMR发现,截短后的SIGR-SRCR对革兰氏阴性菌的结合、凝集能力变弱。SIGR-IG对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌的结合和凝集能力未发生明显变化,推测SIGR-IG结构域对革兰氏阴性菌的结合和凝集起到关键作用,且SRGR结构域和IG结构域在结合和凝集细菌的能力上,具有一定的互补功能。为了进一步研究SIGR-SRCR和SIGR-IG的抗菌功能位点,构建缺失突变体SIGR~(△51-55)(缺失SRCR结构域保守氨基酸位点“WGTVC”)、SIGR~(△203-207)(缺少第一个IG结构域保守氨基酸位点“GxYxC”)和SIGR~(△310-314)(缺少第二个IG结构域保守氨基酸位点“GxYxC”),进行抗菌功能研究发现,突变体SIGR~(△51-55)和SIGR~(△203-207)对革兰氏阳性菌的凝集能力发生了下降,说明SRCR结构域中的保守氨基酸位点“WGTVC”和第一个IG中的保守氨基酸位点“GxYxC”对SIGR凝集革兰氏阳性菌具有重要作用。研究报道人和比目鱼的PIGR能够参与NF-κB信号通路。在ZF4中过表达SIGR,检测发现NF-κB信号通路相关分子MYD88、TRAF6、NF-κB(P65、P50)、TNF-α及下游抗菌肽Defbl1的表达均发生了上调,推测SIGR可能激活NF-κB信号通路。为了进一步确定SIGR激活NF-κB信号通路的功能位点,构建突变体SIGR~(△51-55)、SIGR~(△203-207)和SIGR~(△310-314)并在ZF4细胞中过表达,然而SIGR~(△51-55)和SIGR~(△203-207)对上述相关因子的上调没有发生显著性变化。说明结构域SRCR和IGInfectious hematopoietic necrosis virus1是SIGR调控NF-κB信号通路重要功能位点。对NF-κB信号通路下游抗菌肽Defbl1进行细菌实验,发现Defbl1能够结合、凝集和抑制细菌。扫描电子显微镜观察,Defbl1孵育后的金黄色葡萄球菌和大肠杆菌,发现金黄色葡萄球菌和大肠杆菌表面膜结构严重受损,说明Defbl1能够破坏细菌细胞壁。综上所述,SIGR能够结合并凝集细菌,上调NF-κB信号通路,上调下游抗菌肽Defbl1的表达,从而破坏细菌壁的结构,对细菌进行清除,发挥抑菌功能。

为了探究槟榔应答植原体侵染的分子机理，本研究对染病槟榔与健康槟榔进行转录组比较分析。通过转录组测序共检测到表达基因24 903个，其中355个为可能的抗病基因。染病槟榔与健康槟Trichostatin A采购榔有 1 816个差异表达基因(differentially expressed genes， DEGs)，其中539个DEGs在染病槟榔中上调表达。差异表达基因的GO功能富集分析显示，DNA结合、转录调节活性、DNA结合转录因子活性等13个功能为显著性富集，表明这些功能在槟榔应答植原体侵染过程中发挥特异性作用。通过KEGG信号通路富集分析，富CP-456773价格集基因数最多的是植物与病原互作信号通路，共富集了99个DEGs；其次为植物MAPK信号通路，共富集了76个DEGs；再次为植物激素信号转导信号通路，共富集了68个DEGs，说明上述3个信号通路在应答机medial plantar artery pseudoaneurysm制中发挥了关键作用。值得注意的是，参与病原与寄主互作的99个DEGs包含29个抗病基因，其中Acat00013480、Acat00031368和Acat00027434上调表达，未来这3个基因可作为潜在抗病基因进一步研究。本研究结果可为研究槟榔与植原体互作分子机理及挖掘槟榔黄化病抗病基因提供参考依据。

光热疗法(PTT)作为一种非侵入性的癌症治疗方法,与传统的癌症治疗方法相比,光热治疗可以实现在低氧环境下杀死癌细胞,而不依赖于氧气,具有巨大的应用前景。光热疗法与光热剂(PTA)的选择有直接关系,理想的光热剂应具有较强的近红外吸收、较高的光热转换效率、良好的光稳定性和生物相容性。为此,本论文设计合成了9种基于10位-砜取代罗丹明染料,研究了取代基对此类化合物稳定性的影响,并对其光热性能进行详细探索,后续利用构建的荷瘤小鼠肿瘤模型,进一步验证了其在光声成像辅助光热治疗方面的应用。主要内容包括:(1)近红外砜罗丹明染料的合成和稳定性的研究我们成功制备了9种砜罗丹明化合物,通过核磁共振氢谱、碳谱和高分辨质谱进行表征,确定化合物的结构。紫外吸收光谱测试结果表明该类化合物在700 nm左右有较强的近红外(NIR)吸收,发射波长在730 nm左右。以化合物SO_2R2为例,化合物在CH_2Cl_2溶剂中具有较高的荧光量子产率(0.703),而在H_2O中的荧光量子产率为0.09。为了考察不同取代基对其稳定性的影响,测试了化合物在不同溶剂、p H以及光照下的稳定性,结果表明邻位取代基可PLX4032生产商以有效保护C-9位不受亲核试剂的进攻。通过对不同取代基进行筛选,发现含有CF_3基团的SO_2R2和2,6位取代的SO_wrist biomechanics2R5表现出高稳定性,而对位和间位取代的化合物稳定性较差。我们推测化合物不稳定的原因是由于C-9位容易受到亲核进攻,破坏了化合物的共轭结构,使得化合物的溶液颜色由绿色变为无色selleck S63845,并且该过程是可逆的,加入三氟乙酸后,溶液又逐渐恢复为初始绿色。(2)近红外砜罗丹明染料的光热效应和肿瘤光热治疗的研究我们利用具有较高稳定性的化合物SO_2R2进行了光热治疗方面的研究,经计算得知光热转换效率为53.06%。细胞毒性实验表明其具有低毒性和良好的生物相容性,经过计算得知SO_2R2的IC_(50)为65.82μM。细胞活/死染色实验表明化合物具有高效的光热治疗效果。SO_2R2强的光声信号和良好的生物相容性表明了其在无创监测深层组织病理过程中的潜力。为了评价化合物的肿瘤抑制效果,构建4T1荷瘤小鼠肿瘤模型,能显著抑制肿瘤生长。总之,该光热剂具有优异的光热治疗能力。我们进一步利用具有中等稳定性的化合物SO_2R6进行了可逆的光热治疗研究。光谱测试结果表明,SO_2R6表现出了p H可逆的变色响应,随着溶液p H值的增加(p H>6),溶液颜色由绿色变为无色,在酸性溶液中(p H<6),溶液颜色又恢复为绿色,p K_a约为6。化合物SO_2R6也具有一定的光热效应,计算得出光热转换效率为72.36%,并在酸性水溶液中具有良好的光热稳定性(p H<6)。因此,此类化合物可以实现p H调控的光热治疗。通过细胞毒性和细胞活/死实验表明该化合物具有良好的生物相容性,经过计算得知SO_2R6的IC_(50)为72.52μM。光声成像结果表明SO_2R6产生良好的光声信号。构建4T1荷瘤小鼠肿瘤模型,结果表明该光热剂可以成功地抑制肿瘤的生长。综上,SO_2R2和SO_2R6具有优异的光热治疗能力,可用于光声成像引导下的肿瘤的光热治疗。

近年来,光热纺织品广泛应用于光热治疗,光热杀菌及光热保健等领域。合成(类)黑色素纳米粒子(SMNPs)与天然黑色素纳米粒子(MNPs)具有相似的结构与性能,其光热、防紫外线、粘附性与生物相容性极为突出,并且由于SMNPs的化学无序,可以在其合成过程中加入其他化合物以调控SMNPs的光热性能或增加其他功能。本论文以左旋多巴(L-DA)作为SMNPs的前体与金属离子或硫堇(Th),通过一锅法自氧化聚合形成金属离子或硫堇掺杂的SMNPs,并用这些SMNPs制备光热纺织品。主要研究内容与结果如下:(1)负载纳米银/铁离子络合SMNPs的快速光热杀菌棉织物本部分在左旋多巴自氧化过程中加入Fe~(3+),合成了Fe~(3+)络合的SMNPs(Fe~(3+)-SMNPs),并利用酚羟基的还原性在Fe~(3+)-SMNPs表面原位还原生长纳米银,制备了负载纳米银的Fe~(3+)-SMNPs(Ag NPs@Fe~(3+)-SMNPs)。利用SEM与DLS对Ag NPs@Fe~(3+)-SMNPs的形貌与尺寸进行了分析,其形貌为球型,尺寸在500 nm左右。通过UV-Vis,FTIR光谱与XRD能谱对其化学结构进行了分析,结果证实了Ag NPs@Fe~(3+)-SMNPs的成功合成。并在氙灯(700 m W/cm~2)照射下研究了其分散液的光热性能,结果证实了其光热性能优于原始SMNPs。通过沉积法,利用Ag NPs@selleck Wnt-C59Fe~(3+)-SMNPs构建快速光热杀菌棉织物(Ag NPs@Fe~(3+)-SMNPs@Cotton),对改性棉织物的表面形貌、化学结构、光热、光热杀菌、抗菌及服用性能进行了研究。结果表明,改性后的棉织物表面粗糙,附着有许多Ag NPs@Fe~(3+)-SMNPs。在氙灯照射下,其表面温度在109℃左右,在阳光照射下也有60℃左右。在氙灯照射10min时,其表面大肠杆菌(E.coli)与金黄色葡萄球菌(S.aureus)存活率均在0.4%以下;无氙灯照射时,细菌与改性棉织物接触6 h时,其存活率均在0.7%以下。水洗20次与摩擦100次后,改性棉织物保持了优异的光热和杀菌性能,具有良好的耐水洗与耐摩擦性能。(2)负载Ag-SMNPs的防紫外,光热与抗菌棉织物本部分在左旋多巴自氧化过程中加入Ag~+,合成了既含有Ag NPs又络合Ag~+的Ag-SMNPs。通过SEM与DLS分析了Ag-SMNPs的形貌与尺寸,结果表明Ag-SMNPs呈球状,其粒径在500 nm左右。通过UV-Vis,FTIR,XPS及XRD分析了Ag-SMNPs的化学结构,结果证实了Ag-SMNPs既存在单质Ag又存在络合的Ag~+。在氙灯照射下Ag-SMNPs的光CL 318952热性能也优于SMNPs。通过沉积法,利用Ag-SMNPs构建防紫外线、光热与抗菌多功能棉织物(Ag-SMNPs@Cotton),对改性棉织物的表面形貌、化学结构、防紫外线、光热、光热杀菌,抗菌及服用性能进行了研究。结果表明,改性棉织物表面粗糙,附着有许多Ag-SMNPs。改性棉织物systems medicine的平均UPF值(UPF_(AV))为114.92,其UVB与UVA的平均透过率(T(UVB)_(AV)与T(UVA)_(AV))均低于1.3。氙灯与阳光的照射下,改性棉织物的表面温度分别为113.8℃与58.3℃。氙灯照射10 min时,改性棉织物表面E.coli与S.aureus存活率均在6%以下;无氙灯照射,细菌与改性棉织物接触6 h时,其存活率均在3.4%以下。水洗20次后,改性棉织物各项性能未出现明显下降,具有良好的耐水洗性能。(3)负载Th-SMNPs的快速光热/光动力杀菌棉织物本部分在左旋多巴自氧化过程中加入不同质量的Th,制备了Th-SMNPs-1,2,3(1,2,3分别代表Th/L-DA摩尔比1:10,1:7和1:5)。通过SEM与DLS对Th-SMNPs-1,2,3的形貌与尺寸进行分析,结果表明它们皆成球状,并且Th含量越高,粒径越大,Th-SMNPs-3的粒径在300 nm左右。通过XPS分析了Th-SMNPs-1,2,3的化学结构,结果证实了Th与SMNPs发生了迈克尔加成与希夫碱反应。利用飞行时间质谱,分析了Th-SMNPs-3粗反应液的分子量与Th-SMNPs-3可能的分子结构。在808nm激光(2.0W/cm~2)照射下,测试了Th-SMNPs-1,2,3的光热性能,其中Th-SMNPs-3的光热性能最强。并通过计算得出Th-SMNPs-3的摩尔消光系数ε808值为4.7×10~9 M~(-1) cm~(-1),其总光热效率η*值为34.49%,比SMNPs的η*高出60%。通过DFT理论计算与EPR光谱分析了Th-SMNPs-1,2,3光热增强的机理。Th与L-DA氧化单体形成了D-A结构,Th-SMNPs-1,2,3分子内LUMO-HOMO能带隙减少,促进了光的吸收与转换。Th的掺杂使得半醌自由基的含量增多,抑制了非热辐射跃迁。通过沉积法,利用Th-SMNPs-1,2,3构建了快速光热/光动力杀菌的棉织物(Th-SMNPs-1,2,3@Cotton),对改性棉织物的表面形貌、化学结构、光热、单线态氧(~1O_2)生成、光热/光动力杀菌及服用性能进行了研究。结果表明,改性棉织物表面粗糙,并且Th含量越高,改性棉织物越粗糙。在808 nm激光(0.05-0.5 W/cm~2)照射下,测试了改性棉织物的光热性能,结果表明,Th-SMNPs-3@Cotton的光热性能最强,最高可达100℃。在660 nm激光(0.05 W/cm~2)照射下,Th-SMNPs-3@Cotton生成~1O_2的能力最强。在808nm(0.1 W/cm~2)与660 nm双激光照射下,Th-SMNPs-3@Cotton表面的E.coli与S.aureus存活率均在10%左右。并且,Th-SMNPs-3@Cotton可以作为伤口愈合敷料。

目的:探讨电针对重症肌无力(MG)大鼠症状及CD_4~+/CD_8~+、乙酰胆碱受体抗体(AChR-Ab)水平的影响。方法:随机选择10只无特定病VE-822供应商原体(SPF)级雌性Lewis大鼠作为对照组，剩余大鼠均通过免疫接种法构建实验性自身免疫性重症肌无力(EAMG)模型，成模大鼠随机分为模型组、电针组及泼尼松组，每组10只，其中电针组大鼠每日于阳陵泉、足三里、脾俞穴位处行电针刺激，泼尼松组大鼠灌服泼尼松5.4 mg/(kg·d),对照组、模型组及泼尼松组大鼠每日于非穴位处行电针刺激，连续15 d。记录治疗前后各组大鼠体质量；采用Lennon评分评估大鼠肌力情况；采用肌电图检测重复电刺激(RNS)衰减率；测定胸腺指数；采用酶联免疫吸附试验(ELISA)法检测大鼠血清AChR-Ab、γ干扰素(IFN-γ)、白细胞介素4(IL-4)、白细胞介素6(IL-6)、转化生长因子β_1(TGF-β_1)水平；采用流式细胞术检测大鼠外周血T淋巴细胞亚群CD_4~+/CD_8~+比值变化情况。结果:治疗前，模型组、电针组及泼尼松组体质量低于对照组，临床Lennon评分、RNS衰减率及血清AChR-Ab水平高于对照组(P<0.05),模型组、电针组及泼尼松组体质量、临床Lennon评分、RNS衰减率及血清AChR-Ab水平比较差异均无统计学意义(P>0.05)。治疗后，与对照组比较，模型组、电针组及泼尼松组大鼠体质量降低，临床Lennon评分、RNS衰减率及血清AChR-Ab水平升高，胸腺指数、血清IFN-γ、IL-4、IL-6水平、CD_4~+T细胞占比及CD_4~+/CD_8~+比值升高，血清TGF-β_1水平及CD_8~+T细胞占比降低(P<0.05);与模型组比较，电针组及泼尼松组体质量、血清TGF-β_1水平及外周血CD_8~+T细胞占比升高，临床Lennon评分、RNS衰减率及胸腺指数、血清AChR-Ab、IFN-γ、IL-4、IL-6水平、外周血CD_4~+T细胞占比及CD_4~Medial preoptic nucleus+/CD_8~+比值降低(P<0.05);电针组作用效果弱于泼尼松组(P<0.05)。结论:电针刺激可改善EAMG大鼠临床症状，其MRTX1133化学结构作用机制可能与促进免疫平衡恢复，降低AChR-Ab水平有关。

新型冠状病毒肺炎(Coronavirus diseasebile duct biopsy 2019,COVID-Pevonedistat19)是一种由严重急性呼吸系统综合征冠状病毒 2(Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2,SARS-CoV-2)感染导致的急性呼吸系统传染病,疫情在全球范围大流行导致大量感染、重症及死亡病例,造成巨大的公共卫生与经济负担。目前疫情防控面临新挑战。SARS-CoV-2基因组的不断进化与频繁变异产生了多种变异株,目前流行的Omicron变异株已显示出更强的传播力与明显的免疫逃逸性,对现有疫苗的防护效率及治疗药物的诊疗效果、疫情的防控等造成严峻挑战。在防治药物中,病毒进入抑制剂具备预防病毒感染以及早期应用截断疾病向危重症转化的作用,可同时作为预防与治疗药物使用。然而,目前已获批的如Molnupiravir和Paxlovid等临床用药均以抑制病毒复制为靶,尚缺乏病毒入侵抑制剂供临床应用。面对疫情长期共存、病毒频繁变异导致传播力增强的现状以及大量因基础疾病等无法接种疫苗的人群,研发具备预防与治疗COVID-19的广谱病毒入侵抑制剂具有更强的现实意义。疫情暴发后,连花清瘟胶囊作为中医药抗疫代表性治疗药物被纳入《新型冠状病毒肺炎诊疗方案》批准用于COVID-19的临床治疗。临床研究证实使用连花清瘟胶囊能够提高患者临床治愈率,预防密接与次密接感染;体外研究证实,连花清瘟方能够抑制SARS-CoV-2病毒复制。既往研究明确连花清瘟方对SARS-CoV、H3N2流感病毒、呼吸道合胞病毒等具有广谱抗病毒作用。尽管目前连花清瘟方预防与治疗COVID-19的有效性得到了一定程度的确认,然而其抗SARS-CoV-2及广谱抗病毒的药效物质与作用机制仍有待进一步研究。由于SARS-CoV-2具有高致病性与高传染性,使用完整病毒毒株进行研究需要在生物安全级别(biosafety level,BSL)3级或4级实验室进行。我国高级别生物安全实验室资源紧张,严重限制了 SARS-CoV-2研究,因此,寻找可用于普通生物安全实验室的SARS-CoV-2替代模型十分必要。同时,用于模拟SARS-CoV-2感染的动物或细胞模型与人体存在较大差异,仅能够模拟部分SARS-CoV-2感染特征,也需开发更接近人体真实状况的宿主模型。针对上述问题,课题组已经构建出包含SARS-CoV-2全部结构蛋白的病毒样颗粒(virus-like particles,VLPs),因其仅含有病毒结构蛋白不具有复制能力,是一种安全、仿真的病毒替身模型。作为宿主模型,由人诱导多能干细胞(human induced pluripotent stem cells,hiPSC)诱导分化的肺泡球类器官具有最接近真实人体的蛋白表达谱,可弥补目前宿主模型的缺陷,用于SARS-CoV-2感染研究。研究目的明确连花清瘟方原药及大鼠含药血清中含有的中药化学成分;明确连花清瘟方对SARS-CoV-2病毒入侵宿主细胞的两种途径,内吞与膜融合的影响;筛选连花清瘟方来源的具有抑制SARS-CoV-2病毒入侵宿主细胞的药效成分,并阐明其作用机制。研究方法1.使用连花清瘟方对SD大鼠进行灌胃,获取连花清瘟方含药血清;通过UPLC-MS/MS方法对连花清瘟方原药与大鼠含药血清进行中药化学成分检测;比较连花清瘟方原药与含药血清的中药化学成分,筛选出代谢成分;最后通过文献挖掘方法对连花清瘟方来源中药化学成分抗病毒功效进行归纳整理,筛选候选药物。2.利用病毒样颗粒(virus-like particles,VLPs)与荧光素酶报告基因技术,构建带有荧光素酶标签的SARS-CoV-2 VLPs(Luc-VLPs);以人血管紧张素转换酶 2(angiotensin converting enzyme 2,ACE2)转基因 C57BL/6J 小鼠作为动物模型,使用连花清瘟方及其来源的中药化学成分预防性灌胃给药后,使用VLPs进行干预,构建SARS-CoV-2感染模型,通过检测肺内Luc-VLPs水平,以及利用免疫荧光染色技术可视化肺内VLPs数量,判断连花清瘟方预防SARS-CoV-2感染效果,并利用免疫印迹法对药物干预后ACE2、跨膜丝氨酸蛋白酶2(transmembrane serine protease 2,TMPRSS2)表达水平进行检测,判断药物对SARS-CoV-2入侵相关受体的影响。3.以Vero E6细胞作为SARS-CoV-2通过内吞途径入侵的细胞模型,使用连花清瘟方及其来源的中药化学成分对SARS-CoV-2 VLPs入侵Vero E6细胞过程进行干预,根据入侵细胞内VLPs水平,判断药物对SARS-CoV-2内吞途径进入宿主细胞的影响。4.以二分蛋白法(dual split protein,DSP)构建SARS-CoV-2膜融合途径入侵的细胞模型,使用连花清瘟方及其来源的中药化学成分对SARS-CoV-2膜融合过程进行干预,根据膜融合后形成的绿色荧光蛋白及荧光素酶水平判断药物对SARS-CoV-2膜融合途径入侵宿主细胞的影响。进一步利用DSP法构建SARS-CoV-2突变株及其它冠状病毒SARS-CoV与MERS-CoV膜融合细胞模型,判断连花清瘟方来源化学成分的广谱膜融合抑制效果。5.利用人诱导多能干细胞(human inducedpluripotent stem cells,hiPSC)诱导分化人Ⅱ型肺泡样上皮细胞(alveolar epithelial cells type Ⅱ,AECⅡ),并通过3D培养构建AECⅡ肺泡球模型;利用免疫荧光染色技术检测AECⅡ表达病毒入侵相关受体ACE2以及TMPRSS2水平;利用与人体蛋白表达谱十分相近的AECⅡ肺泡球作为宿主模型,使用筛选所得连花清瘟方来源有效中药化学成分对SARS-CoV-2 VLPs入侵AECⅡ进行干预,进一步判断药物对SARS-CoV-2病毒颗粒入侵宿主细胞的影响。6.对具有抑制SARS-CoV-2膜融合功效的连花清瘟方来源中药化学成分(山奈酚)的作用机制做进一步研究,通过检测药物对膜融合不同阶段的影响,判断药物作用靶点。首先,检测药物对SARS-CoV-2 S蛋白受体结合域(spike protein receptor-binding domain,S-RBD)与宿主细胞受体 ACE2 结合过程的影响。使用药物对S-RBD与表达ACE2的HEK-293F细胞的结合过程进行干预,利用流式细胞术检测与ACE2结合的S-RBD水平判断药物对S-RBD与ACE2结合的影响。进一步,检测药物对宿主TMPRSS2对S蛋白S2亚基切割过程的影响。利用瞬时转染技术构建表达TMPRSS2的HEK-293T细胞,使用药物对该细胞对TMPRSS2荧光底物Boc-QAR-AMC的切割过程进行干预,根据荧光信号判断药物对TMPselleck激酶抑制剂RSS2酶切活性的影响;利用瞬时转染技术分别构建表达TMPRSS2的HEK-293F-ACE2细胞与表达SARS-CoV-2 S蛋白的HEK-293T细胞,将两细胞混合,模拟TMPRSS2对S蛋白切割过程,使用药物对这一过程进行干预,利用蛋白免疫印迹法检测切割后产物,判断药物对TMPRSS2对S蛋白酶切过程的影响;通过分子对接技术预测药物与TMPRSS2的亲和力及结合位点;利用表面等离子共振(surface plasmon resonance,SPR)技术对山奈酚与S蛋白不同亚基的结合亲和力进行检测;利用细胞热位移技术,使用药物对表达SARS-CoV-2 S蛋白的HEK-293T细胞进行干预,使用蛋白免疫印迹法检测经过不同温度处理后细胞表达的S蛋白含量,判断药物是否具有与S蛋白结合能力。最后,检测药物对S2亚基上负责完成膜融合的七肽重复序列1与2(heptad repeat 1/2,HR1/2)形成 6-螺旋束(six-helix bundle,6-HB)的影响。利用圆二色谱技术,检测药物对HR1与HR2的二级结构以及形成6-HB过程的影响;利用非变性凝胶电泳技术及氨基酸突变技术,检测药物对预测作用靶点氨基酸突变前后HR1、HR2以及形成6-HB过程的影响;利用原子力显微镜,在气相观测条件下检测药物对HR1、HR2以及6-HB结构稳定性的影响。研究结果1.从连花清瘟方原药与大鼠含药血清中共检测出129种中药化学成分,其中9种成分仅在大鼠含药血清中检出,为原药代谢产物;经过文献挖掘,38种连花清瘟方来源的中药化学成分对34种巴尔的摩病毒分类法Ⅰ至Ⅵ类不同病毒有明确文献报道的抗病毒功效,其抗病毒作用机制包括抑制病毒黏附、进入、复制、合成、释放以及直接破坏病毒结构等。2.连花清瘟方预防性给药动物实验结果显示,模型组小鼠肺内VLPs水平升高至背景组的2330±399%(p<0.005),阳性对照药物熊去氧胆酸(ursodeoxycholic acid,UDCA)组肺内 VLPs 水平降低至 232±72%(p<0.005),连花清瘟方组肺内VLPs水平降低至267±101.8%(p<0.005);免疫荧光染色结果显示,模型组小鼠肺组织细胞内可见大量VLPs颗粒,连花清瘟方与阳性对照药物UDCA干预组肺组织细胞内VLPs数量显著降低;免疫印迹实验结果显示UDCA干预降低了小鼠肺ACE2表达水平,而连花清瘟方干预不影响ACE2表达水平。上述结果提示连花清瘟方具有预防SARS-CoV-2感染功效,并且其预防感染效果不通过改变宿主ACE2发挥作用。3.连花清瘟方原药与含药血清对SARS-CoV-2入侵宿主细胞的两种途径,内吞与膜融合均具有抑制作用;从连花清瘟方含有的129种中药化学成分中,结合文献对药物抗病毒功效的报道,筛选出芦荟大黄素、大黄酸、连翘酯苷A、连翘酯苷Ⅰ、连翘苷、野黑樱苷、红景天苷、广藿香酮、山奈酚、芦丁、地奥司明、香叶木素、木犀草素、新绿原酸、甘草酸、α-亚麻酸、绵马贯众素ABBA共17种中药化学成分进行后续研究;结果显示,这17种药物对SARS-CoV-2病毒颗粒内吞途径入侵宿主细胞均无抑制作用;其中山奈酚对SARS-CoV-2 S蛋白、ACE2与TMPRSS2共同介导的膜融合过程具有明显抑制作用。4.连花清瘟方来源中药化学成分(山奈酚)预防性给药动物实验结果显示,模型组小鼠肺内VLPs水平升高至背景组的2480±220%(p<0.005),山奈酚组肺内VLPs水平降低至1944±103%(p<0.005);免疫荧光染色结果显示,模型组小鼠肺组织细胞内可见大量VLPs颗粒,山奈酚干预组肺组织细胞内VLPs数量显著降低;蛋白免疫印迹实验结果显示山奈酚干预不影响小鼠ACE2表达水平。上述结果提示山奈酚具有预防SARS-CoV-2感染功效,并且其预防感染效果不通过改变宿主ACE2发挥作用。进一步以与人体蛋白表达谱十分接近的AECⅡ作为宿主模型的体外细胞实验证实,山奈酚干预组细胞内VLPs水平较模型组降低了 46.3±15.8%(p<0.005),山奈酚具有整体抑制SARS-CoV-2病毒颗粒入侵AECⅡ的功效。5.山奈酚不影响SARS-CoV-2 VLPs通过内吞途径入侵Vero E6细胞;在SARS-CoV-2 S蛋白与ACE2介导的膜融合过程中,山奈酚仅对同时存在TMPRSS2的膜融合过程具有抑制作用(p<0.005);山奈酚同时对SARS-CoV-2 Delta、Omicron 突变株(BA.1、BA.2、BQ.1.1、XBB.1)以及 SARS-CoV、MERS-CoV具有广谱膜融合抑制作用。随后的机制研究证实,山奈酚不影响SARS-CoV-2 S-RBD与ACE2的结合,但对TMPRSS2酶活性具有一定的抑制作用(p<0.005)。分子对接结果证实山奈酚能够与TMPRSS2酶活性位点Ser 441结合。SPR以及细胞热位移实验发现,山奈酚与S蛋白,特别是S2亚基存在相互作用。对山奈酚对S2亚基中驱动膜融合的HR的作用研究中发现,在圆二色谱检测中,山奈酚抑制HR1与HR2形成6-HB,并对HR1二级结构中的α-螺旋构象具有破坏作用;在非变性凝胶电泳检测以及原子力显微镜观测中发现,山奈酚能够破坏HR1与HR2结构稳定性,抑制6-HB的形成;氨基酸突变结果显示,赖氨酸残基对于HR1结构稳定性具有正向调节作用,对HR2结构稳定性具有负向调节作用;山奈酚对赖氨酸突变的HR丧失了破坏作用提示山奈酚的作用靶点是HR中的赖氨酸残基。研究结论1.利用带有荧光素酶标签的复制缺陷型SARS-CoV-2 Luc-VLPs结合人ACE2转基因小鼠动物模型和AECⅡ模型能够在一定程度上复现SARS-CoV-2病毒颗粒入侵宿主细胞的生物学过程,可用于研究药物对病毒颗粒入侵宿主阶段的影响。2.连花清瘟方对SARS-CoV-2入侵宿主细胞的两种途径,内吞与膜融合均具有抑制效果,连花清瘟方来源的中药化学成分——山奈酚具有广谱膜融合抑制功效,两药物作为SARS-CoV-2病毒进入抑制剂均具有预防SARS-CoV-2感染的功效。3.山奈酚抑制膜融合作用机制为靶向S2亚基HR区赖氨酸残基,破坏HR结构稳定性,抑制6-HB形成。发现赖氨酸残基对HR结构稳定性的影响为进一步深入认识冠状病毒HR结构以及基于山奈酚作为先导化合物开发靶向HR的广谱膜融合抑制剂提供实验研究基础。

目的 分析艾滋病合并Vorinostat体内实验剂量中枢性马尔尼菲篮状菌病患者的临床特点，提高临床早期诊断水平。方法 回顾性Imidazole ketone erastin小鼠分析2014—2020年南宁市第四人民医院收治的5例经脑脊液培养确诊马尔尼菲篮状菌感染的艾滋病患者的临床资料。结果 5例艾滋病合并中枢性马尔尼菲蓝状菌感染者中男性4例，平均年龄35.2岁。脑脊液检出马尔尼菲篮状菌平均时间8 d。脑脊液改变主要表现为白细胞计数和蛋白质升高，葡萄糖和氯化物降低。头颅影像检查主要表现为颅内感染灶。5例患者IgE immunoglobulin E结局均死亡，其中2例误诊为中枢性结核分枝杆菌感染，2例病情危重入院不足1周死亡，1例经过有效抗真菌治疗但最终因感染性休克死亡。3例既往接受过规范抗人类免疫缺陷病毒(HIV)治疗。结论 艾滋病合并中枢性马尔尼菲篮状菌病临床表现缺乏特异性，早期诊断困难，临床易误诊、漏诊，病死率高，临床应高度重视。