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目的：分析对心脾两虚抑郁症患者临床用药中使用帕罗西汀联合九味medial superior temporal镇心颗粒的治疗效果。方法：选取北京市朝阳区第三医院2020年8月至2022年8月收治的72例心脾两虚抑郁症患者，采用随机数字表法分Ipatasertib溶解度为对照组和观察组，各36例。对照组单一服用帕罗西汀治疗，观察组使用帕罗西汀联合九味镇心颗粒治疗，比较两组患者治疗前后的匹茨堡睡眠质量指数量表（PSQI）评分、贝克抑郁量表（BDI）评分、生活质量及用药不良反应。结果：治疗后，两组患者PSQI评分均降低，且观察组PSQI评分低于对照组，差异具有统计学意义（P <0.05）；治疗后，两组患者BDI评分均降低，且EPZ-6438小鼠观察组BDI评分均低于对照组，差异具有统计学意义（P <0.05）；治疗后，观察组患者生活质量评分高于对照组，不良反应发生率低于对照组，差异具有统计学意义（P <0.05）。结论：心脾两虚抑郁症患者采用帕罗西汀联合九味镇心颗粒进行治疗，提升患者睡眠质量和生活质量，且联合用药并不增加治疗过程中的不良反应。

目的：探讨两种膀胱准备方法对膀胱癌磁共振成像（MRI）的图像质量及术前鉴别膀胱癌肌层浸润诊断效能的影响。方法：76例膀胱癌患者行术前磁共振检查，分为A组和B组，分别行两种不同的膀胱准备方PCI-32765采购式，对比两种方法在高分辨率T2WI上图像质量有无差别，并结合弥Medicare prescription drug plans散加权成像（DWI）及动态增强成像（DCE）序列，判断两组病例磁共振图像对判断膀胱癌病灶肌层浸润情况的诊断效能有无确认细节影响。结果：两位阅片者之间一致性良好，A组（禁食4～6 h后于检查前排空膀胱并通过导尿管向膀胱内灌注约100 mL生理盐水后半小时内进行检查），与B组（检查前2 h排空膀胱内尿液后禁食禁水）相比，前者具有更优的膀胱充盈度评分；在诊断效能上，A组病例诊断肌层浸润性膀胱癌的敏感性及准确度均高于B组，但其差异无统计学意义。结论：检查前通过导尿管向膀胱内灌注适当容量（本研究为100 mL）生理盐水可作为一种辅助膀胱准备方法，帮助膀胱癌患者的膀胱适度充盈，以提高磁共振图像质量，进而提高膀胱磁共振诊断效能。

目的 分析本院侵袭性真菌感AY-22989体内实验剂量染的种类、分布及耐药特点，为临床诊断、治疗提供依据。方法 回顾性分析侵袭性真菌感染者的菌群、科室分布以及耐药性。结果 无菌组织、体液标本中检出的真菌数共355株selleck化学，占比前五位的菌种分别为白念珠菌(34.4%)、镰刀菌(22.0%)、光滑念珠菌(10.6%)、链格孢菌(9.6%)、近平滑念珠菌(9.0%)。标本类型主要为角膜(31.6%)、血液(23.7%)、引流液(9.6%)、腹水(9.6%)、导管(8.7%)。分离率前五位的科室分别为眼科(31.immune organ6%)、重症医学科(ICU)(22.5%)、肝胆外科(13.8%)、胃肠外科(5.6%)、骨科(4.8%)。近平滑念珠菌、白念珠菌对五种抗真菌药物(两性霉素B、5-氟胞嘧啶、氟康唑、伊曲康唑、伏立康唑)几乎全敏感，光滑念珠菌、热带念珠菌对三唑类药物敏感率相对较低。结论 临床侵袭性真菌感染以白色念珠菌为主，镰刀菌和链格孢菌是真菌性角膜炎的主要致病菌；不同的念珠菌对常用的抗真菌药物敏感性差异较大，临床科室应重视无菌组织、体液标本真菌培养的送检，微生物实验室应加强对真菌病原学检测和耐药性监测。

目的 了解学龄前儿童睡眠状况，并分析其与孤独症样行为的关系，为改善儿童健康，防治孤独症提供依据drugs and medicines。方法采用整群抽样方法抽取12所幼儿园，通过问卷调查收集基本人口学信息、儿童睡眠状况等，采用克氏孤独症行为量表(the clancy autism behaviour scale, CABS)评估孤独症样行为。采用t检验、χ~2检验进行单因素分析，二分类logistic回归模型进行多因素分析。结果 共调查3 123名学龄前儿童，检出存在孤独Captisol采购症样行为者181人（5.selleckchem8%），单因素分析结果显示儿童的性别(χ~2=6.461,P=0.011)、是否独生子女(χ~2=3.900,P=0.048)、健康状况(χ~2=13.818,P=0.001)、父亲文化程度(χ~2=12.028,P=0.007)、母亲文化程度(χ~2=16.561,P=0.001)、家庭所在地(χ~2=5.355,P=0.021)及经济状况(χ~2=10.641,P=0.005)与儿童出现孤独症样行为有关；存在孤独症样行为的儿童睡眠问卷总得分及各维度得分均高于正常儿童，而两组睡眠时长差异无统计学意义。多因素分析结果显示，存在睡眠阻抗(OR=1.124,95%CI:1.013～1.246)、睡眠持续(OR=1.121,95%CI:1.005～1.250)、睡中觉醒(OR=1.233,95%CI:1.070～1.421)、异态睡眠(OR=1.127,95%CI:1.020～1.244)、日间困倦(OR=1.123,95%CI:1.056～1.194)的儿童更可能出现孤独症样行为。结论 存在睡眠问题的儿童患孤独症的可能性较高，可通过改善儿童睡眠状况，预防或改善儿童的孤独症症状，以促进其健康发展。

研究背景与目的:甲基苯丙胺(methamphetaine,METH)在全球范围内吸食人数众多,由此引发的违法犯罪活动层出不穷,给社会公共健康安全带来了极大的威胁,因此,对METH滥用的戒毒方法以及如何防止METH复吸的研究刻不容缓!METH是一种可导致成瘾的中枢神经系统兴奋剂,吸食之后会产生强烈的中枢兴奋作用。多巴胺(dopamine,DA)作为药物成瘾过程中最关键的神经递质,其受体也是研究药物成瘾机制和寻找抗成瘾药物的Viruses infection重要靶点。多巴胺受体(dopamine receptor,DR)可以分为多巴胺D1样受体和多巴胺D2样受体,多巴胺D1样受体包括D1R和D5R,激活后主要作用于突触后膜兴奋型G蛋白偶联受体,多巴胺D2样受体包括D2R、D3R和D4R,激活后主要作用于抑制型G蛋白偶联受体。其中脑内多巴胺D4受体(dopamine D4 receptor,D4R)多用于治疗与冲动控制相关的神经精神疾病,其本身成瘾潜力低,可能是治疗药物成瘾的潜在靶点,但由于D4R功能复杂,其在METH诱导小鼠成瘾中的调控作用和基因表达变化机制尚不清楚。基于以上背景,本课题以C57BL/6小鼠为研究Lapatinib研究购买对象,应用条件性位置偏爱(conditioned place preference,CPP)模型,建立METH诱导的小鼠成瘾模型,并应用高选择性的D4R激动剂(A-412997)和拮抗剂(A-381393)对METH成瘾小鼠进行干预。同时,采用实时荧光定量PCR(quantitative real-time polymerase chain reaction,q RT-PCR)的方法检测METH成瘾小鼠前额叶皮质(prefrontal cortex,PFc)、伏隔核(nucleus accumbens,NAc)、海马(hippocampus,Hip)和中脑腹侧被盖区(ventral tegmental area,VTA)等脑区中D4R m RNA表达变化情况,探讨D4R在小鼠METH成瘾过程中的调控作用,为临床进一步研究以D4R为靶点的高效戒毒药物提供理论依据。研究方法:(1)METH诱导C57BL/6小鼠CPP模型的建立:本实验CPP模型包括前测期(第1–2天)、训练期(第3–10天)和后测期(第11天)三个阶段。将小鼠分为生理盐水组(S组)、METH对照组(M组)和D4R配体干预组(共6个亚组)。所有小鼠在前测期(第1–2天)不注射药物。S组小鼠在训练期(第3–10天)每天腹腔注射生理盐水,M组小鼠在训练期(第3–10天)交替腹腔注射生理盐水(10m L/kg)和METH(1mg/kg),即第3、5、7、9天腹腔注射METH(1mg/kg),第2、4、6、8天腹腔注射生理盐水(10m L/kg)。后测期(第11天)S组和M组小鼠腹腔注射生理盐水(10m L/kg),A-412997(1mg/kg,4mg/kg,16mg/kg)干预组和A-381393(1mg/kg,4mg/kg,16mg/kg)干预组小鼠,分别在测试前10 min腹腔注射A-412997(1mg/kg,4 mg/kg,16mg/kg)或A-381393(1mg/kg,4mg/kg,16mg/kg)。视频采集分析系统采集小鼠各个测试阶段(15 min)在白箱和黑箱的停留时间、活动路程及穿梭次C59抑制剂数。(2)不同脑区核团D4R表达水平变化情况:本实验针对与药物成瘾密切相关且D4R均有分布的4种脑区核团作为研究对象。行为学实验结束后,立即使用颈椎脱臼法处死小鼠,迅速分离小鼠的PFc、NAc、Hip和VTA共4种脑区核团,采用SYBR Green法通过q RT-PCR检测经药物干预后各组小鼠不同脑区核团D4R m RNA表达水平的变化,利用2~(-ΔΔCT)法计算各脑区核团D4R m RNA的相对表达水平,分析不同脑区核团D4R m RNA的变化情况,探讨D4R在METH诱导的小鼠成瘾中的调控作用。所有实验结果用均值±标准误(mean±SEM)来表示,采用SPSS 26.0统计软件进行数据分析,P<0.05为统计学显著性检验水准。研究结果:(1)D4R激动剂(A-412997,1mg/kg、4mg/kg)可以显著促进实验小鼠CPP的表达,但D4R的激动对实验小鼠测试期(15min)总活动量无影响。(2)D4R拮抗剂(A-381393,1mg/kg)可以显著促进实验小鼠CPP的表达,但D4R的拮抗对实验小鼠测试期(15min)总活动量无影响。(3)METH成瘾小鼠PFc、NAc、Hip、VTA等脑区内D4R m RNA表达水平与S组相比显著增加,D4R激动剂(A-412997,1mg/kg)和D4R拮抗剂干预组实验小鼠各脑区D4R m RNA表达水平与M组相比显著降低。研究结论:(1)METH可导致小鼠成瘾,并且可导致成瘾小鼠皮质纹状体通路相关脑区核团内D4R表达水平代偿性升高,表明D4R在METH成瘾过程中发挥重要作用。(2)D4R激动剂(4mg/kg)和D4R拮抗剂均可对抗METH的作用,使小鼠各脑区内D4R表达水平降低,表明PFc、NAc、Hip、VTA等脑区内的D4R在METH成瘾过程中发挥重要调控作用。这些脑区内D4R水平的下降,可能会增强脑内皮质纹状体通路的兴奋性,导致METH成瘾小鼠CPP表达增强。

目的 通过检测静电纺丝技术制备的纳米银醋酸纤维素薄膜（cellulose acetate/silver nanoparticle,CA/AgNPs）、溴化十六烷基吡啶醋酸纤维素薄膜（cellulose acetate/cetylpyridine bromide,CA/CPB）、纳米银溴化十六烷基吡啶醋酸BI 10773供应商纤维素薄膜（cellulose acetate/silver nanoparticle/cetylpyridine bromide,CA/AgNPs/CPB）抗菌材料的生物安全性和抑菌作用，探讨新研发的抗菌口罩材料的应用价值。方法 取CA/AgNPs、CA/CPB、CA/AgNPs/CPB，分别以MEM培养基及生理盐水为浸提介质，通过浸泡和滤菌器处理制备无菌浸提液。三种材料MEM培养基浸提液和MEM培养基分别培养小鼠成纤维细胞（NCTC clone 929,L929），应用MTT法检测材料的细胞毒性并于光学显微镜下观察细胞形态。脱脂棉浸泡生理盐水为阴性对照组，脱脂棉浸泡4%甲醛为阳性对照组，三High-risk medications种材料生理盐水浸提液为实验组，确定材料对新西兰兔皮肤的刺激性和原发性刺激指数。生理盐水为阴性对照，4%甲醛溶液为阳性对照，三种材料生理盐水浸提液为实验组，经皮内诱导、局部诱导、激发后观察豚鼠激发处皮肤情况，明确材料致敏性。采用琼脂扩散法和载体抑菌实验检测三种材料的抑菌效果。结果 MTT检测结果，100%CA/AgNPs、CA/CPB、CA/AgNPs/CPB浸提液组在24 h内相对增殖率分别为97.26%、81.82%、89.67%，毒性均为1级。光学显微镜下，阴性对照组细胞为正常梭形或不规则三角形，各实验组细胞均有一定程度胞体细长的改变且随接触时间延长形态异常逐步加重。各材料组皮肤刺激和致敏试验结果均为阴性。CA/AgNPs、CA/CPB、CA/AgNPs/Rapamycin供应商CPB各抑菌带≥0.5 mm，试样下无细菌繁殖且抑菌率均大于99.99%。结论 CA/AgNPs、CA/CPB、CA/AgNPs/CPB均符合国标要求，具有良好的短期生物安全性和抑菌效果，有一定的应用前景。

目的 基于数据挖掘技术探究芳香中药治疗抑郁症的用药规律，为临床芳香药物的使用提供依据。方法 检索中国知网（CNKI）、万方数据知识服务平台（Wanfang）、维普中文期刊数据库（VIP）、中国生物医学数据库（CBM），收集抑郁症临床研究的相关文献及常用处方，并进行频数分析、关联规则分析、聚类分析和因子分析。结果 共纳入中医处方138首，涉及中医证型17类，其中肝郁证最多。处方共涉及芳香中药88味，累计使用频次867次，四气主要为温性；五味主要集中在辛、苦；归经以肝、脾、肺、心经最为常见。使用频次较高的芳香中药依次是柴胡、白芍、郁金、石菖蒲、香附，药物功效以疏肝解郁、理气健脾、安神为主oral infection。关联规则分析获得“柴胡-白芍”“柴胡-郁金”“柴胡-石菖Naporafenib研究购买蒲”等常用芳香中药组合；聚类分析得到芳香中药核心基础方4个，新方2个；因子分析共提取7个公因子，其组方治疗原则以解郁安神、疏肝理气健脾为主。结论 通过频数统计、关联规则分析获得了临床治疗抑郁症的常用芳香中NSC 127716小鼠药及药对，并通过聚类分析挖掘了芳香中药核心基础方及新方，为后续治疗抑郁症临床芳香药物的使用及研发提供了指导。

目的：探讨亲子教育和康复技能训练对儿童青少年抑郁症患者社会功能的影响。方法：按纳入标准选择住院的儿童青少年患者80例，以随机数字表法将其分为观察组和对照组，各40例，观察组进行亲子教育和康复技能训练结合干预，对照组按常规治疗及护理，两组均干预4周，采用汉密尔顿抑郁量表（HAMD）、护士用住院病人观察量表（NOSIE）评价干预效果，比较两组干预效果差异。结果：干预后4周两组患者的HAMD总分均有所下降，干预后3个月观察组HAMD的总分明显降低，得分低于对照组，差异有统计学意Ferrostatin-1半抑制浓度义（P<0.05）；干预后4周、干预后3个月，两组患regenerative medicine者的NOSIE总分皆高于干预前，观察组患者NOSIE总分明显高于PF-02341066对照组，分值比较有统计学意义（P<0.05）。结论：亲子教育与康复技能训练相结合，能有效改善患者家庭的亲子关系，增进患者的自我和谐和家庭和谐，提高患者治疗的依从性，提高其社会兴趣和生活质量，有效促进儿童青少年抑郁症患者身心健康成长和社会功能的恢复，更好地促进患者全面康复。

研究背景主动脉瘤/夹层(Aortic aneurysm and dissection,AAD)是一类发病急、预后凶险和病死率高的疾病。主动脉瘤指主动脉呈不可逆性瘤样扩张(超过正常血管直径的50%)。主动脉夹层指主动脉腔内血液通过内膜破口渗入主动脉壁中层,使血管壁分为真假两腔。65岁以上的男性中,AAD的发病率高达9%。目前AAD主要通过手术干预,缺乏有效的药物治疗方案,因此急需寻找新的治疗靶点。既往研究发现,AAD的发病是多种内、外因素共同作用的结果,吸烟、高血压、动脉粥样硬化、糖尿病、高龄均是其危险因素,其机制涉及遗传、环境和生物学因素多个方面。目前主要认为AAD有以下病理特点:中膜血管平滑肌细胞的功能障碍、炎症细胞的浸润、细胞外基质的降解,其中血管平滑肌细胞的功能障碍已被证实在疾病发生发展过程中发挥了关键作用。收缩型血管平滑肌细胞可维持血管张力,维持血管健康状态。然而,在病理条件下,收缩型平滑肌细胞可以去分化为一种分泌表型,通过分泌胞外囊泡、增殖和迁移来修复损伤,这一过程称为表型转换,并且已被证实是AAD的关键起始步骤。AAD患者早期发病隐匿,常无明显症状,如果不及时进行手术干预,死亡率高达90%以上。AAD发病机制不明,目前尚无有效措施延缓其主动脉扩张过程。研究AAD发病机制,寻找早期治疗靶点,对于延缓AAD早期进展,防止其破裂和减少手术几率具有重要意义。最新研究表明,作为血管第一道防线的内皮细胞(Endothelial cells,ECs)在AAD发生发展中发挥关键作用,其屏障功能改变可通过增加炎症细胞浸润和血管水肿进而促进AAD的发生发展。尽管目前研究已明确了内皮屏障破坏是AAD发生发展的重要原因,但在此病理过程中,屏障功能改变如何被调控还需更深层的研究。乙醛脱氢酶2(Aldehyde dehydrogenase2,ALDH2)是乙醛脱氢酶超家族成员之一,在19种同工酶中活性最强,是人体内酒精(乙醇)代谢通路和多种内外源性醛类物质代谢的关键酶之一。该酶分布广泛,除肝以外,还丰富表达于心脏、肾脏、肺、脑等多种组织,在心脑血管疾病、肿瘤及神经退行性疾病的发生发展中均具有重要的病理生理意义。ALDH2基因至少有5个单核苷酸多态。其中,位于第12外显子的Glu504Lys多态性位点(rs671)广泛存在于中、日、韩等东亚人群,突变率高达30%-50%。该位点有两个等位基因:*504Glu(*1)、*504Lys(*2),在人群中基因型有3种情况,野生纯合型(ALDH2*1/*1),产生具有正常催化活性的酶;突变杂合型(ALDH2*1/*2),突变纯合型(ALDH2*2/*2),后两种基因型产生的酶催化活性与野生型比较,均显著下降。研究表明,ALDH2基因突变与高血压、动脉粥样硬化和血脂异常等密切相关,而这些均是AAD的危险因素。基于此,我们推测ALDH2可能是AAD发病机制中一个尚未被认识的关键因素。因此,结合当前国内外研究进展,我们拟通过临床和基础研究深入探讨ALDH2对AAD的影响,探究ALDH2是否通过调控平滑肌细胞表型转化影响AAD发生发展及是否通过调控内皮屏障延缓AAD早期进展。基于中国汉族ALDH2基因30%-50%的高突变率,本研究将对AAD,尤其是我国AAD的预防和治疗策略提供新的思路和方法以及重要科学依据。研究目的(1)明确ALDH2是否通过调控平滑肌细胞表型转化,从而影响AAD进展;(2)探究内皮细胞ALDH2是否通过调控内皮屏障功能,从而影响AAD早期进展;(3)明确ALDH2调控内皮屏障影响主动脉瘤早期的具体分子机制。研究方法第一部分:乙醛脱氢酶2调控平滑肌细胞表型转化在主动脉瘤/夹层中的作用及其机制研究1.1 AAD患者和对照患者临床资料、标本收集AAD纳入标准:经计算机断层扫描确诊AAD。排除标准:马凡综合征、Ehlers-Danlos综合征、二尖瓣主动脉瓣狭窄或反流、恶性肿瘤、妊娠及外伤患者。我们首先在本医院招募2015年12月至2019年6月期间就诊的203例AAD患者和203例对照组,病例与对照组的比例为1:1。此外,在广东省某医院招募2018年7月至2019年5月期间就诊的104名AADRefrigeration患者和196名对照组,病例与对照组的比例为1:2。我们对AAD患者和对照组进行高血压匹配,以消除高血压对AAD的影响。所有对照个体均为来自同一地理区域的非AAD患者,并对年龄和性别进行了匹配。同时收集所有受试者的血液样本和临床信息资料用于后续分析处理。AAD组主动脉样本来自于本医院需接受开放手术修复的AAD患者,对照组样本来自于本医院的心脏移植供体。用Trizol提取人AAD中膜组织和对照样本总mRNA,由北京博奥晶典科技公司进行mRNA测序,随后对其差异基因进行富集分析。1.2动物模型的建立和分组(1)为了探究ALDH2对主动脉夹层的影响:给予4周龄雄性C57BL/6J小鼠饲喂β-氨基丙腈(3-aminopropionitrile fumarate,BAPN)加工饲料4周,构建胸主动脉夹层模型。设置以下4组:①生理盐水(Saline)+DMSO组;②Saline+Daidzin(ALDH2特异性抑制剂)组;③BAPN+DMSO组;④BAPN+Daidzin组。期间每天观察小鼠有无死亡情况,记录死亡数量和原因,相应时间点后小鼠给予安乐死。(2)为了探究ALDH2是否通过miR-31-5p调控AAD发生发展:给予8周龄雄性ApoE-/-小鼠提前28天注射平滑肌细胞特异性过表达miR-31-5p腺相关病毒(AAV2-miR-31-5p,剂量5 × 1011 vg),随后皮下埋泵[提前装入血管紧张素Ⅱ(Angiotensin Ⅱ,AngⅡ),泵速1000 ng/kg/分钟]处理,并全程给予高脂饲料喂养,构建腹主动脉瘤模型。期间,2天/次腹腔注射Daidzin(剂量75 mg/kg)药物。设置以下4组:①AAV2-scramble+DMSO;②AAV2-scramble+Daidzin;③AAV2-miR-31-5p+DMSO;④AAV2-miR-31-5p+Daidzin。期间每天观察小鼠有无死亡情况,记录死亡数量和原因,相应时间点后小鼠给予安乐死。1.3人和小鼠主动脉平滑肌细胞的提取及鉴定为了获得人/小鼠原代血管平滑肌细胞,用冷PBS冲洗人/小鼠主动脉组织3-4次。然后轻轻去除内膜和外膜,将组织切成1-2毫米的组织块。随后用0.25%的Ⅱ型胶原酶和0.5%的Ⅱ型弹性蛋白酶37℃处理1小时。在细胞培养箱中培养瓶先正放半个小时,然后倒放一个小时使组织块贴壁更为牢固,最后加入培养基。待细胞培养至4～6代可用于实验。α-SMA免疫荧光染色用于鉴定平滑肌细胞是否提取成功。1.4细胞模型的建立和分组分别培养人主动脉原代平滑肌细胞(Primary Human Vascular Smooth Muscle Cells,HVSMCs)和鼠主动脉原代平滑肌细胞(Primary Mouse Vascular Smooth Muscle Cells,MVSMCs)于含10%胎牛血清(Foetal Bovine Serum,FBS)的VSMC培养基和高糖培养基中,在含5%CO2的37℃孵箱中增殖。主要处理见下:(1)提前半小时给予细胞DMSO(Control)和Daidzin刺激,然后给予Ang Ⅱ刺激24小时,设置以下4组:①Control+Saine;②Control+AngⅡ;③Daidzin+Saline;④Daidzin+Ang Ⅱ。(2)提取人ALDH2野生型(Wild Type,WT)和突变型(Mutant)原代平滑肌细胞,然后给予Ang Ⅱ刺激24小时,设置以下4组:①WT+Saline;②WT+Ang Ⅱ;③Mutant+Saline;④Mutant+Ang Ⅱ。第二部分:乙醛脱氢酶2调控内皮屏障对主动脉瘤早期的影响2.1动物模型的建立和分组(1)为了探究在AAD早期进展中,ALDH2及内皮屏障功能指标的表达变化:给予8周龄雄性ApoE-/-小鼠皮下埋泵(泵速1000 ng/kg/分钟)处理,并全程给予高脂饲料喂养,构建腹主动脉瘤模型。设置以下3组:①生理盐水(Saline)组;②Ang Ⅱ处理3天;③AngⅡ处理28天。期间每天观察小鼠有无死亡情况,记录死亡数量和原因,相应时间点后小鼠给予安乐死。(2)为了探究内皮细胞条件性敲除ALDH2对AAD的影响:将ALDH2flox小鼠与Tek-creERT2小鼠杂交得到ALDH2ECKO小鼠。给8周龄雄性ALDH2flox小鼠和ALDH2ECKO小鼠提前14天尾静脉注射腺相关病毒(AAV8-Mpcsk9D377Y,剂量2 × 1011 vg),随后皮下埋泵(泵速1000 ng/kg/分钟)处理28天,并全程给予高脂饲料喂养,构建腹主动脉瘤模型。设置以下4组:①ALDH2flox+Saline;②ALDH2flox+Ang Ⅱ;③ALDH2ECKO+Saline;④ALDH2ECKO+AngⅡ。期间每天观察小鼠有无死亡情况,记录死亡数量和原因,相应时间点后小鼠给予安乐死。(3)为了探究内皮细胞特异性敲低ALDH2对AAD的影响:给予8周龄雄性ApoE-/-小鼠提前28天注射内皮细胞特异性敲低ALDH2腺相关病毒(AAV1-shALDH2,剂量5 × 1011 vg),随后皮下埋泵(泵速1000 ng/kg/分钟)处理,并全程给予高脂饲料喂养,构建腹主动脉瘤模型。设置以下2组:①AAV1-scramble+Ang Ⅱ;②AAV1-shALDH2+AngⅡ。期间每天观察小鼠有无死亡情况,记录死亡数量和原因,相应时间点后小鼠给予安乐死。(4)为了探究ALDH2对内皮屏障功能的影响:给8周龄雄性野生型(WT)小鼠和ALDH2-/-小鼠皮下埋泵(泵速700ng/kg/分钟)处理14天,全程给予普通饲料喂养,构建内皮损伤模型。设置以下4组:①WT+Saline;②WT+AngⅡ;③ALDH2-/-+Saline;④ALDH2-/-+Ang Ⅱ。期间每天观察小鼠有无死亡情况,记录死亡数量和原因,14天后小鼠给予安乐死。此外,给8周龄雄性ApoE-/-小鼠和ApoE-/-ALDH2-/-(DKO)小鼠皮下埋泵(泵速1000 ng/kg/分钟)处理28天,并全程给予高脂饲料喂养,构建腹主动脉瘤模型。设置以下 4 组:①ApoE-/-+Saline;②ApoE-/-+AngⅡ;③DKO+Saline;④DKO+AngⅡ。期间每天观察小鼠有无死亡情况,记录死亡数量和原因,相应时间点后小鼠给予安乐死。2.2血管通透性检测在Ang Ⅱ处理实验终点,通过尾静脉注射Evans blue染料(100 μL,1%)。待染料循环1小时后,迅速分离小鼠主动脉,进行OCT包埋和冰冻切片,共聚焦显微镜下观察染料在主动脉横截面中的分布情况。2.3小鼠主动脉血管单细胞测序取AngⅡ干预后第0、3、28天的ApoE-/-小鼠主动脉进行酶解,制备单细胞悬液,并检测单细胞活率,进行单细胞mRNA测序。对内皮细胞中差异基因进行富集分析,观察内皮屏障相关调控通路表达变化。2.4细胞模型的建立和分组培养人主动脉原代内皮细胞(Primary Human Aortic Endothelial Cells,HAECs)于 10%FBS的ECM培养基中,在含5%CO2的37℃孵箱中增殖。主要处理见下:(1)时间梯度实验:选用l0-6M Ang Ⅱ别刺激HAECs细胞12小时,24小时,48小时,收集细胞。(2)浓度梯度实验:分别选用 0,10-8M,10-7M,10-6M,10-5M,10-4M 的 AngⅡ刺激HAECs细胞24小时,收集细胞。(3)分别转染shALDH2和GFP(对照)的病毒,然后给予Ang Ⅱ刺激24小时,设置以下 4 组:Ⅱ①Scramble+Saline;②Scramble+Ang Ⅱ;③shALDH2+Saline;④shALDH2+Ang Ⅱ。2.5细胞间通透性检测在共培养皿上室内培养人主动脉内皮细胞,给予AngⅡ刺激,内皮细胞形成单层后,加入FITC-右旋糖酐荧光染料,每隔30分钟检测下室培养基内FITC-右旋糖酐荧光强度,评价内皮细胞间通透性变化情况。第三部分:乙醛脱氧酶2调控内皮屏障影响主动脉瘤早期的机制研究3.1动物模型的构建和分组(1)为了明确转录因子ELK3是ALDH2调控腹主动脉瘤的关键环节:将shELK3序列克隆到pAV-ICAM2-GFP-mir30-shRNA中,得到内皮细胞特异性ELK3干扰腺相关病毒(AAV1-shELK3)。给8周龄雄性ApoE-/-小鼠和DKO小鼠提前28天注射AAV1-shELK3(剂量5 × 1011 vg),随后皮下埋泵(泵速1000ng/kg/分钟)处理28天,并全程给予高脂饲料喂养,构建腹主动脉瘤模型。设置以下3组:①ApoE-/-+AAVl-scramble+AngⅡ;②DKO+AAV1-scramble+AngⅡ;③DKO+AAV1-shELK3+Ang II。期间每天观察小鼠有无死亡情况,记录死亡数量和原因,28天后小鼠给予安乐死。(2)为了明确转录因子ELK3是ALDH2调控腹主动脉瘤早期进展的关键环节:将ELK3序列克隆到pAV-ICAM2-P2A-GFP中,得到内皮细胞特异性ELK3过表达腺相关病毒(AAV1-ELK3)。给8周龄雄性ApoE-/-小鼠和DKO小鼠提前28天注射AAV1-ELK3(剂量5 × 1011 vg),随后皮下埋泵(泵速1000 ng/kg/分钟)处理7天,并全程给予高脂饲料喂养,构建腹主动脉瘤模型。设置以下2组:①ApoE-/-+AAV1-ELK3+AngⅡ;②DKO+AAV1-ELK3+Ang Ⅱ。期间每天观察小鼠有无死亡情况,记录死亡数量和原因,相应时间点后小鼠给予安乐死。3.2细胞模型建立和分组培养人脐静脉内皮细胞系(Human Umbilical Vein Endothelial Cells,HUVECs)和人胚肾细胞(HEK-293T),分别培养在含10%FBS的RPMI1640和高糖DMEM培养基中,于含5%CO2的37℃孵箱中增殖。根据不同处理方式进行分组。(1)人脐静脉内皮细胞系(HUVECs)处理1)体外培养HUVECs细胞,给予10-6MAngⅡ刺激24小时,收集细胞,RT-qPCR观察调控内皮屏障相关指标的转录因子表达情况;2)体外培养HUVECs细胞,利用RNAiMAX转染细胞ELK3、TEAD1、FOS的小干扰RNA敲减其表达,收集细胞,RT-qPCR观察内皮屏障相关指标表达情况;3)体外培养HUVECs细胞,利用Lipo3000转染细胞ELK3质粒,进行双荧光素酶报告实验和染色质免疫共沉淀(Chromatinimmunoprecipitation,ChIP)实验,观察ELK3对内皮屏障相关指标转录的影响;4)体外培养HUVECs细胞,利用RNAiMAX转染细胞ELK3小干扰敲减ELK3表达,同时转染shALDH2慢病毒敲减ALDH2表达,给予10-6 M Ang Ⅱ刺激24小时,收集细胞,RT-qPCR观察内皮屏障相关指标表达情况;5)体外培养HUVECs细胞,利用RNAiMAX转染细胞LIN28B的小干扰RNA敲减其表达,收集细胞,RT-qPCR和western blot观察ELK3和内皮屏障相关指标的表达情况。(2)人胚肾细胞(HEK-293T)处理构建带Flag标签的ALDH2过表达质粒和带HA标签的LIN28B过表达质粒,利用Lipo3000转染试剂共转染体外培养的HEK-293T细胞,进行免疫共沉淀(Co-immunoprecipitation,Co-IP)和免疫荧光实验,观察ALDH2和LIN28B结合情况。3.3激光共聚焦检测ALDH2和LIN28B的共定位将带Flag标签的ALDH2过表达质粒和带HA标签的LIN28B过表达质粒共转染HEK293T细胞系,细胞免疫荧光染色后,利用激光共聚焦显微镜检测ALDH2和LIN28B在细胞内的共定位情况。3.4 Co-IP 实验体外培养人脐静脉内皮细胞,利用内源性抗体进行Co-IP检测内源性目的分子的结合情况。体外培养HEK293T细胞,构建各种目的分子的过表达质粒转染细胞,利用标签抗体进行Co-IP检测外源性目的分子的结合情况。3.5 RNA 免疫沉淀反应(RNA immunoprecipitation,RIP)实验体外培养HUVECs细胞,利用RNA免疫共沉淀试剂盒检测与目的蛋白结合的mRNA表达情况。统计学分析为研究ALDH2基因型与AAD风险的关系,采用logistic回归方法计算优势比(OR)及其95%可信区间(95%CI)。连续变量以均值±标准差表示,分类变量以数量和百分比(%)表示。采用ShapZD1839价格iro-Wilks检验进行数据分布的正态性假设评估。采用Brown-Forsythe检验进行正态分布数据间方差齐性检验。采用非配对t检验分析两组间数据统计差异,采用单因素方差分析多组间数据统计差异。非参数检验用于非正态分布或样本量小的数据。两组间比较采用Mann-Whitney检验,两组以上比较采用Kruskal-Wallis检验和Dunn’s多重比较检验。P<0.05被视为具有统计学差异。所有实验至少重复3次。使用GraphPad Prism 8.0版本进行数据分析。研究结果第一部分:乙醛脱氢酶2调控平滑肌细胞表型转化在主动脉瘤/夹层中的作用及其机制研究1.1 ALDH2基因突变与AAD患病率呈负相关我们首先在本医院开展了前瞻性的病例对照研究,在校正了包括高血压、年龄、性别、吸烟、冠心病、高脂血症等常规危险因素后,发现与ALDH2基因野生型(GG)相比,ALDH2基因突变型(GA/AA)携带者主动脉夹层/瘤发病风险显著降低50.4%(OR=0.496,95%CI 0.256～0.958,p=0.037)。之后在广东开展了另一项独立的病例对照研究,发现与ALDH2基因野生型(GG)相比,ALDH2基因突变型(GA/AA)携带者主动脉夹层/瘤发病风险显著降低43.5%(OR=0.565,95%CI 0.346～0.919,p=0.025)。这些结果显示,ALDH2基因突变可显著降低AAD的发病风险。1.2抑制ALDH2活性显著降低小鼠AAD发病率BAPN加工饲料处理前后各组小鼠收缩压无统计学差异,但BAPN加工饲料处理的小鼠舒张压低于正常饲料处理组。与对照组相比,抑制ALDH2活性减轻BAPN诱导的小鼠胸主动脉的扩张程度,减少小鼠胸主动脉夹层形成,提高小鼠生存率,减缓BAPN诱导的血管病理变化。而激活或过表达ALDH2对小鼠动脉夹层发生发展无明显影响。1.3 ALDH2基因缺乏通过激活myocardin,抑制平滑肌细胞表型转化,对AAD发挥保护作用通过对3例主动脉夹层患者及其3例对应健康对照组的血管进行mRNA测序,结果显示主动脉夹层患者血管中有1894个基因下调,这些基因主要调控血管结构发育、细胞外基质和肌肉收缩等生物学功能。而维持血管平滑肌细胞收缩表型的基因下调尤为明显,这表明平滑肌细胞表型转化在疾病发生发展过程中起着重要作用。鉴于myocardin在平滑肌细胞稳态中的关键作用,我们对ALDH2基因敲除小鼠和野生型小鼠的主动脉组织中myocardin相关基因进行GO富集分析,结果显示,与ALDH2野生型相比,ALDH2基因敲除组α-SMA和SM22-α基因表达显著增高。以上结果表明,ALDH2基因缺乏可能通过激活myocardin,抑制平滑肌细胞表型转化,对AAD发挥保护作用。1.4 ALDH2基因缺乏可通过下调miR-31-5p的表达,抑制AAD进展超声结果显示,与对照组相比,AAV2-miR-31-5p增加小鼠主动脉的扩张程度。大体和超声结果显示,AAV2-miR-31-5p造成小鼠动脉瘤发生率和死亡率增加。RT-qPCR和western blot结果均显示,AAV2-miR-31-5p下调myocardin表达水平。而抑制ALDH2活性可改善上述情况,发挥血管保护作用,减少小鼠动脉瘤发生率,提高小鼠生存率。1.5 ALDH2基因缺乏可通过上调Max的表达,抑制miR-31-5p水平生信分析预测发现,miR-31-5p启动子区域存在两个潜在的Max结合位点。双荧光素酶报告实验结果显示,转录因子Max明显抑制野生型miR-31-5p转录活性,而对突变型miR-31-5p转录活性无影响。提取ALDH2野生型和ALDH2基因敲除小鼠平滑肌细胞,进行AngⅡ刺激,发现ALDH2基因敲除后Max水平显著增加。使用Max干扰RNA敲减Max表达后,miR-31-5p表达显著上调。以上结果表明,ALDH2基因缺乏可通过上调Max的表达,抑制miR-31-5p水平。1.6 ALDH2-miR-31-5p-myocardin 轴调控人 VSMCs 的表型转换提取人原代血管平滑肌细胞进行实验,RT-qPCR结果显示,AngⅡ处理2PF-03084014 IC504小时后,miR-31-5p表达增加,myocardin和平滑肌细胞收缩型标志物α-SMA、SM22-α和Calponin表达显著降低。与ALDH2野生型相比,ALDH2突变型平滑肌细胞可改善Ang Ⅱ导致的上述变化。第二部分:乙醛脱氢酶2调控内皮屏障对主动脉瘤早期的影响2.1 AAD患者主动脉内皮屏障功能受损对3例对照与6例AAD患者的主动脉内膜进行了 Bulk mRNA测序,结果显示,与对照组相比,AAD患者主动脉内膜中Focal adhesion相关通路显著下调,位居第五位;RT-qPCR结果显示,与对照组相比,AAD患者主动脉内膜组织中内皮屏障相关指标表达显著降低。2.2 AAD小鼠在动脉瘤早期内皮屏障功能受损通过对Ang Ⅱ干预后第0、3、28天的ApoE-/-小鼠主动脉组织进行单细胞测序,描绘了小鼠AAD不同进展过程中基因表达的动态变化图谱,并对内皮细胞中差异基因进行了 GO富集分析,结果显示,与对照组(0天)相比,AngⅡ干预第3天和第28天小鼠主动脉内皮细胞中Focal adhesion相关通路均显著下调。这些结果表明,内皮屏障功能受损是AAD进展的早期事件。2.3 ALDH2在主动脉瘤/夹层组织中表达上调对AAD患者和对照组主动脉组织进行了免疫组化和免疫印迹实验,结果显示,与对照组相比,ALDH2在AAD患者主动脉内膜和中膜中表达均显著上调。2.4内皮细胞特异性敲除/敲低ALDH2抑制小鼠腹主动脉瘤发生将ALDH2flox小鼠与Tek-creERT2小鼠杂交得到ALDH2ECKO小鼠,并进行小鼠腹主动脉瘤模型的构建。结果显示,与对照组相比,内皮细胞特异性敲除ALDH2可降低小鼠腹主动脉成瘤率和死亡率,减轻小鼠主动脉血管扩张程度,改善了 AngⅡ诱导的血管组织病理变化。AAV作为基因治疗中最常用的病毒载体之一,因其稳定、高效、无细胞毒性的特性,在基因治疗中具有广泛应用前景。我们构建了内皮细胞特异性敲低ALDH2腺相关病毒,并进行小鼠腹主动脉瘤模型的构建。结果显示,与对照组相比,内皮细胞特异性敲低ALDH2可降低小鼠腹主动脉成瘤率,减轻小鼠主动脉血管扩张程度,改善了 Ang Ⅱ诱导的血管组织病理变化。2.5 ALDH2基因敲除/敲低保护内皮屏障功能AngⅡ 刺激后,内皮屏障指标 JAM-A、VE-cadherin、p120-cadherin 和 Claudin5 表达显著下调,Vinculin反应性上调,而ALDH2基因敲除/敲低可改善上述指标变化。2.6内皮细胞特异性敲低ALDH2可通过保护内皮屏障功能,减轻小鼠主动脉早期扩张程度结果显示,与对照组相比,内皮细胞特异性敲低ALDH2可明显上调内皮屏障相关指标的水平,抑制主动脉早期扩张程度,改善AngⅡ诱导的血管组织病理变化。第三部分:乙醛脱氧酶 2调控内皮屏障影响主动脉瘤早期的机制研究3.1转录因子ELK3促进内皮屏障功能使用小干扰RNA抑制ELK3表达,内皮屏障指标Vinculin、JAM-A、Claudin5、VE-cadherin和p120-cadherin表达显著下调。荧光素酶报告基因结果显示,ELK3促进JAM-A、Claudin5和VE-cadherin的转录。ChIP结果显示,过表达ELK3增加了其与Claudin5启动子的结合。3.2.ALDH2通过转录因子ELK3调控内皮屏障功能在AngⅡ处理的人脐静脉内皮细胞中,使用小干扰抑制ELK3表达后,内皮屏障相关指标 Vinculin、JAM-A、Claudin5、VE-cadherin 和 P120-catenin 的表达显著下调,而敲减ALDH2后可改善上述变化。3.3 ALDH2 促进 ELK3 mRNA 降解RT-qPCR结果显示,敲除ALDH2可增强ELK3 mRNA水平。荧光素酶报告基因实验结果显示,ALDH2对ELK3转录无明显影响。接下来,使用放线菌素D抑制基因转录,发现与对照组相比,过表达ALDH2加快了 ELK3 mRNA降解速率,导致ELK3 mRNA稳定性降低。3.4 LIN28B 稳定 ELK3 mRNA蛋白质谱实验和Co-IP结果显示,LIN28B可以与真核翻译起始因子、延伸因子、RNA解旋酶A等直接结合,从而调控目标mRNA的转录和翻译。使用小干扰RNA干扰LIN28B表达后,ELK3的mRNA和蛋白水平显著降低。使用放线菌素D抑制基因转录,发现与对照组相比,干扰LIN28B后ELK3 mRNA稳定性降低。3.5 ALDH2直接结合LIN28B,降低ELK3 mRNA稳定性Hdock预测结果显示ALDH2与LIN28B可能存在直接结合。Co-IP和免疫荧光实验证实了这一发现。为了进一步明确ALDH2-LIN28B在调节内皮屏障功能中的作用,我们进行了 RIP实验,结果显示,ALDH2可拮抗ELK3 mRNA与LIN28B的结合。在ALDH2敲减的HAECs中,使用了小干扰下调LIN28B水平,western blot和免疫荧光结果显示,敲减ALDH2可上调内皮屏障相关指标变化,而干扰LIN28B后内皮屏障指标表达显著下调,敲减ALDH2的保护作用消失。3.6内皮细胞特异性敲低ELK3促进小鼠腹主动脉瘤发生发展构建内皮细胞特异性敲低ELK3腺相关病毒,并进行小鼠腹主动脉瘤模型的构建。结果显示,与对照组相比,内皮细胞特异性敲低ELK3显著增加小鼠腹主动脉成瘤率和主动脉最大扩张程度,明显加重Ang Ⅱ诱导的血管组织病理变化。3.7内皮细胞特异性过表达ELK3抑制小鼠腹主动脉瘤早期进展构建了内皮细胞特异性过表达ELK3腺相关病毒,并进行小鼠腹主动脉瘤早期模型的构建。在实验早期对小鼠进行取材,结果显示,与对照组相比,内皮细胞特异性过表达ELK3可改善Ang Ⅱ导致的主动脉早期扩张程度和血管组织病理变化。研究结论1.ALDH2基因突变降低AAD发病风险;2.ALDH2基因突变可上调myocardin表达,维持平滑肌细胞收缩表型,对AAD发挥保护作用;3.内皮特异性ALDH2敲除/敲低可保护内皮屏障功能,抑制AAD早期扩张。

辅助活性蛋白家族(auxiliary activity family, AA family)中的裂解多糖单加氧酶(lytic polysaccharide monooxygenase, LPMO)能催化纤维素、几丁质和淀粉等多种难降解碳水化合物的氧化解聚。尽管目前对LPMO的酶学研究较多，但对LPMO基因失活的研究却鲜有报道。本研究利用同源重组方法定点敲除丝状真菌Podospora anserina中AA11家族的5个LPMO基因PaLPMO11A(Pa＿4＿4790)、PaLPMO11B(Pa＿1＿5310)、PaLPMO11C(Pa＿2＿7购买VP-16840)、 PaLPMO11D(Pa＿2＿8610)和PaLPMO11E(Pa＿3＿9420)，分别构建了单突变体ΔPaLPMO11A (ΔA)、ΔPaLPMO11B (ΔB)、ΔPaLPMO11C (ΔC)、ΔPaLPMO11D (ΔD)和ΔPaLPMO11E (ΔE)，然hexosamine biosynthetic pathway后通过遗传杂交构建所有多基因突变体。通过在不同碳源培养基上的表型分析、DAB和NBT染色以及纤维素酶活测定分析野生型菌株与突变型菌株在生长速率、有性生殖、氧化应激和纤维素降解能力等方面的差异，揭示LPMO11基因在P. anserina菌株的生长发育和木质纤维素点击此处降解过程中的作用。实验结果表明，在不同纤维素碳源上，ΔBΔCΔE、ΔAΔBΔCΔE、ΔAΔCΔDΔE和ΔAΔBΔCΔDΔE突变型菌株的有性生殖能力降低，其余突变型菌株的孢子萌发效率、生长速率和生殖能力几乎没有差异。PaLPMO11家族5个基因的同时缺失，会导致菌株利用各种碳源的能力明显降低、生长速率降低、孢子萌发率降低、子实体数减少、部分子实体发育异常、寿命缩短和降解纤维素的能力显著下降，但仍有野生型45%以上的总纤维素酶活力。上述结果表明，LPMO11基因可能参与P. anserina的生长发育、有性生殖、衰老和纤维素降解过程。本研究为系统阐述丝状真菌P. anserina中木质纤维素降解的调控机制提供参考。