研究背景:家族性高胆固醇血症(familial hypercholesterolemia,FH)是一种常见的遗传性疾病,以血浆低密度脂蛋白胆固醇(low-density lipoprotein cholesterol,LDL-C)水平升高为特征,与皮肤黄色瘤、腱黄色瘤、脂性角膜弓以及早发动脉粥样硬化性心血管疾病(atheroscleroticcardiovasculardiseOrganic mediaase,ASCVD)有关。目前 FH 的发病率逐年上升,但其就诊率及社会认知度仍较低,早期识别诊断FH并进行干预,可有效预防心血管事件的发生。迄今为止,临床中发现的APOB c.676G>A位点突变在国内外未有研究报道,本研究根据先证者及其家系的临床资料及基因检测结果,对该突变位点进行功能验证及临床特征分析,探讨该突变位点的致病性及可能的致病机制,从而为寻找FH新的防治措施提供基因学数据支持。研究方法:1.资料收集:收集先证者及相关家庭成员的病史资料,采集空腹外周血,检测血脂及血糖水平,绘制家系图谱。对先证者及其母亲进行全外显子基因测序,寻找与临床表型高度相关的突变位点,对其他相关的家系成员进行突变位点验证,并对可能致病的突变位点进行测序分析及蛋白结构预测。2.质粒构建:构建表达APOB48-Flag基因的野生型及突变型质粒,构建同时表达增强绿色荧光蛋白EGFP和APOB48-Flag基因的野生型及突变型质粒。3.质粒转染:通过体外培养人肝癌细胞(HepG2)及人胚肾细胞(HEK293T),分别与CON组(无质粒转染),WT组(表达APOB48-Flag基因的野生型质粒),Mut组(表达APOB48-Flag基因的突变型质粒),WT-EGFP组(同时表达增强绿色荧光蛋白EGFP和APOB48-Flag基因的野生型质粒),Mut-EGFP组(同时表达增强绿色荧光蛋白EGFP和APOB48-Flag基因的突变型质粒)共转染。利用荧光显微镜观察质粒转染结果。通过DAPI染色及荧光显微镜观察野生型APOB及突变型APOB在细胞中的表达位置。4.功能验证:通过q-PCR、蛋白质印迹评估突变位点的转录水平及蛋白表达情况,并利用q-PCR实验研究APOB c.676G>A位点突变对其他血脂调控基因的影响。5.统计分析:通过Image J、GraphPad Prism 9将所得数据进行统计分析,P<0.05则认为差异有统计学意义。研究结果:1.通过对先证者三代家系的临床病史资料收集及血脂检验结果分析,筛选出了几名可能诊断为FH的患者,其中先证者的总胆固醇水平(Cho 16.5mmol/L)以及低密度脂蛋白胆固醇水平(LDL-C 10.66mmol/L)明显升高,符合家族性高胆固醇血症的特征。此外,先证者的母亲、舅舅、外祖母也可诊断为高胆固醇血症。2.先证者及其母亲的全外显子基因测序结果发现了三个与临床表型高度相关的突变位点:APOB c.676G>A、INSR c.4028G>A 及 AKT2 c.433G>C。通过对相关家系成员进行突变位点验证,确定APOB(c.676G>A,p.A226T)基因突变可能与该家系的高脂血症相关。该突变位点此前在国内外尚未有研究报道,临床意义未明。3.多个氨基酸序列比对结果表明,A226T在不同物种中是保守的。APOB(c.676G>A,p.A226T)为错义杂合突变,编码区第676个核苷酸从鸟嘌呤到腺嘌呤的突变导致了第226位氨基酸从丙氨酸到苏氨酸的突变。该位点的突变在氨基酸226位和684位之间增加了一个氢键,影响了蛋白的空间结构域,导致基因的生物学功能发生了改变。4.质粒稳定转染后在荧光显微镜下可看到野生型AEmpagliflozinPOB及突变型APOB(c.676G>A)均主要在细胞质表达。q-PCR和蛋白印迹实验表明APOB(c.676G>A)的突变未影响转录及蛋白表达水平。值得注意的是,APOB(c.676G>A)突变会导致三酰基甘油(Triacylglycerol,TAG)合成基因(L3-MA溶解度PIN1、LPIN2、DGAT2)、脂肪生成基因(FASN、ACACA、SREBF1、PPARGC1B)和脂肪酸氧化的基因(CPT1A)的mRNA表达水平升局。研究结论:1.本研究通过对一个FH家系的临床病史资料收集及基因测序分析,发现了 APOB突变位点(c.676G>A,p.A226T),该基因突变与FH临床表型高度相关。2.APOB(c.676G>A,p.A226T)位点突变导致 TAG 合成基因(LPIN1、LPIN2、DGAT2)和脂肪生成基因(FASN、ACACA、SREBF1、PPARGC1B)的表达水平升高,引起血液循环中胆固醇和甘油三酯增多,与先证者的FH病史和急性胰腺炎的反复发作相关。3.对于本例FH先证者,联合使用降脂药物,同时辅以低脂饮食和适当锻炼可改善血脂控制状况,提示早期诊断可使患者得到早期治疗,进而有效预防心血管事件的发生。