研究背景:原发性肝癌(Primary liver cancer)是最常见的恶性肿瘤之一,在每年新确诊的恶性肿瘤病例中排第6位,而每年因肝癌致死的病例数更是排到了第2位;其中有50%以上的新确诊及死亡病例发生在我国。原发性肝癌中85-90%病理类型是肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma HCC)。HCC的治疗手段多种多样,其中以外科手术治疗为主,如肝切除术、肝移植术,TACE、RFA等,亦可以联合靶向、免疫治疗及放疗等治疗手段。近年来,HCC的临床治疗取得了一些进展,但由于肝切除术、肝移植等具有严格的手术适应证及禁忌证只适合少数患者,而且大多数HCC患者确诊时已经是肿瘤晚期,或伴有严重的肝功能不全等基础疾病,无法进行肝切除术或肝移植术,需要系统的全身综合抗肿瘤治疗,以期降低肿瘤分期、改善肿瘤相关症状、改善生活质量以及延长生存期,其中包括化疗、分子免疫治疗、放疗及中药抗肿瘤辅助治疗等。虽然随着针对HCC的抗癌药物的不断推陈出新,但HCC的整体预后仍不理想,所以对新型抗癌药物、新靶点及相关机制的研究迫在眉睫。铁死亡(Ferroptosis)是一种新近发现的细胞死亡调节形式,它通常伴随着细胞内过量的游离Fe2+产生及脂质过氧化,这种死亡方式与许多病理过程有关,包括肿瘤、退行性改变、缺血再灌注损伤等。在形态学上,发生铁死亡的细胞有正常大小的细胞核,染色质形态正常,但存在线粒体浓缩以及线粒体膜密度增加的改变,所以不同于细胞凋亡、细胞焦亡。在生物化学方面的特征为细胞内铁离子的异常积聚和脂质过氧化物的过量产生。自从提出铁死亡这一概念,铁死亡就与抗肿瘤密切相关,现已知铁死亡可以作为包括肺癌、结直肠癌、乳腺癌等多种恶性肿瘤的死亡形式,甚至对一些经过经典抗肿瘤药物治疗后产生耐药的癌症也起到明显的抗肿瘤作用。铁蛋白主要储存在人体中的肝脏,而且肝癌组织中的铁含量更是明显高于正常肝脏组织,因此,铁死亡诱导剂可以作为HCC的治疗药物的潜在靶点具有相当可观的前景。自噬作为细胞维持自身稳态的一种重要方式,与各种细胞死亡方式密切相关。有文献报道自噬对铁MC3使用方法死亡的发生及进展起到了关键性的作用,亦提出了自噬依赖性铁死亡的概念,这可能与选择性的铁蛋白自噬,细胞内活性氧ROS的产生,以及铁Modern biotechnology死亡过程中复杂的氧化还原反应及能量变化有关。腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)作为能量传感器,通过控制自噬和蛋白质降解等多种内稳态机制来调节能量稳态和代谢应激。mTOR在整合代谢、能量、激素和营养信号以促进生物合成途径和抑制自噬分解代谢过程中发挥重要作用。AMPK-mTOR信号通路作为自噬的上游通路,参与并启动自噬,AMPK负向调节mTOR,通过促进AMPK磷酸化,降低mTOR磷酸化水平,触发自噬通量,进而激活自噬。但AMPK在铁死亡中的是否存在变化,能否调控铁死亡的进展,及其相关的具体机制等,目前尚未明确。马钱子碱(Brucine)作为一种天然的小分子化合物,最初是从马钱子种子中提取的,呈弱碱性。马钱子作为一种传统的中药成分,其中有效的治疗成分即马钱子碱,一般用于治疗炎症及创伤等引起的相关疼痛。马钱子碱具有一定的抗肿瘤活性,现已知其可以通过影响肿瘤细胞增殖、抑制癌细胞侵袭迁移及抗血管生成等机制,对包括结肠腺癌、乳腺癌、胶质瘤等多种类型的肿瘤产生可观的抗肿瘤作用。然而,马钱子碱是否对HCC具有抗肿瘤作用,以及铁死亡和AMPK是否都参与马钱子碱诱导的HCC细胞死亡仍不清楚。研究目的:本研究旨在探讨马钱子碱能否诱导HCC细胞死亡,其诱导的死亡方式中是否存在铁死亡,以及AMPK在其诱导的铁死亡中具体的机制及作用。研究方法:1、MTT法、平板克隆:计算IC50,并检测马钱子碱对HCC细胞及正常肝细胞的毒性作用。2、LDH释放试验:检测马钱子碱对HCC细胞的杀伤作用,以及在使用抑制剂等预处理后马钱子碱对HCC细胞杀伤作用的差异。3、Fe2+、ROS、MDA检测:通过检测马钱子碱及马钱子碱加入抑制剂后HCC细胞的Fe2+、ROS及脂质过氧化程度的变化,来研究马钱子碱诱导HCC细胞铁死亡与自噬之间的关系。4、谷胱甘肽(GSH)检测法:通过马钱子碱对HCC细胞内GSH含量的影响,来验证马钱子碱对HCC细胞抗氧化系统的影响。5、Western Blotting:通过检测马钱子碱及加入抑制剂、敲除ATG5/AMPK后样品在铁代谢及自噬相关蛋白表达的差异,分析马钱子碱诱导HCC细胞铁死亡与自噬之间的关系及相互作用。6、C11-BODIPY581/591染色法、ROS荧光法:通过荧光显微镜检测马钱子碱及在铁死亡特异性抑制剂预处理后对诱导各HCC细胞系细胞脂质过氧化程度及ROS的变化。7、siRNA沉默法:通过siRNA靶向敲减ATG5、AMPK后,检测马钱子碱诱导下HCC细胞相应指标的变化,研究自噬与铁死亡之间的关系及相互作用。8、裸鼠皮下荷瘤实验:通过皮下荷瘤,建立小鼠HCC转移瘤模型,通过腹腔注射马钱子碱,观察其在HCC体内模型的抗肿瘤作用;并通过瘤体组织检测相关Fe2+、MDA含量,Western Blotting检验瘤体组织相应蛋白表达情况;通过HE染色检验马钱子碱对小鼠心脏、肝脏、肺、脾脏、肾脏的影响;通过Ki 67染色来研究马钱子碱在体外实验中对HCC细胞增殖的影响。结果:1、MTT实验结果提示:马钱子碱可以抑制HCC细胞的增殖。2、LDH实验结果提示:马钱子碱可以诱导HCC细胞的死亡,并且铁死亡特异性抑制剂(DFO、Fer-1)、自噬特异性抑制剂(3-MA、Baf-A1)、AMPK特异性抑制剂(Dor)可以有效的抑制马钱子碱诱导的HCC细胞死亡;siRNA分别敲减ATG5、AMPK后亦可以有效抑制马钱子碱诱导的HCC细胞死亡。3、Fe2+检测结果提示:马钱子碱可以诱导HCC细胞内Fe2+浓度的升高,呈时间及浓度依赖性,并且铁死亡特异性抑制剂(DFO、Fer-1)、自噬特异性抑制剂(3-MA、Baf-A1)、AMPK特异性抑制剂(Dor)可以有效的抑制马钱子碱诱导的HCC细胞内Fe2+浓度的升高;siRNA分别敲减ATG5、AMPK后亦可以有效抑制马钱子碱诱导的HCC细胞内Fe2+浓度的升高。4、活性氧ROS检测提示:马钱子碱可以诱导HCC细胞内ROS含量的升高,呈时间及浓度依赖性,并且铁死亡特异性抑制剂(DFO、Fer-1)、自噬特异性抑制剂(3-MA、Baf-A1)、AMPK特异性抑制剂(Dor)可以有效的抑制马钱子碱诱导的HCC细胞内ROS含量的升高;siRNA分别敲减ATG5、AMPK后亦可以有效抑制马钱子碱诱导的HCC细胞内ROS含量的升高。5、丙二醛(MDA)检测提示:马钱子碱可以诱导HCC细胞脂质过氧化,呈时间及浓度依赖性,并且铁死亡特异性抑制剂(DFO、Fer-1)、自噬特异性抑制剂(3-MA、Baf-A1)、AMPK特异性抑制剂(Dor)可以有效的抑制马钱子碱诱导的HCC细胞发生的脂质过氧化;siRNA分别敲减ATG5、AMPK后亦可以有效抑制马钱子碱诱导的HCC细胞发生的脂质过氧化。6、谷胱甘肽(GSH)检测结果提示:马钱子碱可以降低HCC细胞内GSH的含量,呈时间及浓度依赖性。7、C11-BODIPY581/591染色法、ROS荧光法提示:马钱子碱诱导的HCC脂质过氧化可以被铁死亡特异性抑制剂(DFO、Fer-1)所抑制。马钱子碱可以诱导HCC细胞的ROS含量升高。8、Western Blotting结果提示:在固定时间内固定浓度下马钱子碱单独诱导、及在各组特异性抑制剂预处理、及siRNA靶向敲减后马钱子碱诱导HCC细胞在自噬相关蛋白、铁代谢相关蛋白及抗氧化系统相关蛋白存在表Lapatinib化学结构达性差异。9、裸鼠皮下荷瘤实验:提示马钱子碱通过腹腔注射能够抑制HCC细胞在体内的增殖,并伴有肿瘤组织内Fe2+、MDA水平升高,并呈浓度依赖性。通过HE染色检验马钱子碱对小鼠心脏、肝脏、肺、脾脏、肾脏的无明显结构性损伤;通过Ki 67染色来研究马钱子碱在体外实验中可显著抑制HCC细胞增殖。结论:1、马钱子碱在体内及体外能抑制HCC细胞增殖并诱导HCC细胞死亡。2、马钱子碱可以诱导HCC细胞发生铁死亡。3、马钱子碱可以诱导HCC细胞发生自噬性死亡。4、马钱子碱通过活化AMPK介导HCC细胞发生自噬,并调控铁死亡。