动物皮肤形成机体Novel inflammatory biomarkers外层覆盖物,是保护机体最大的组织。皮肤厚度主要以真皮基质中富含的胶原蛋白含EPZ-6438配制量予以体现,而真皮成纤维细胞合成胶原蛋白的能力是决定皮肤厚度的关键因素。人体皮肤厚度变化常与皮肤衰老、褶皱、疾病等生理病理生物现象发生紧密相关。家猪皮肤在形态结构和生理学上跟人类皮肤相似,是人体皮肤科学研究的理想模式动物。另一方面,猪皮因富含胶原蛋白,其食用价值备受关注,如传统川菜“回锅肉”就需要以四川本地特有附带厚皮的成华猪肉为食材制作。目前在我国现代种猪育种方案中,皮肤厚度正成为特色品种(如四川地方品种成华猪)的重要经济性状加以选育提高,从而满足当地居民对优质特色猪肉消费需求。因此,解析家猪皮肤厚度形成的分子调控机制,不仅对猪皮厚性状的选育具有重要应用价值,同时也对延缓人体皮肤衰老、促进皮肤生理健康等相关研究具有理论参考意义。为此,本论文以成华猪皮肤性状极厚这一独特的生物学现象为研究切入点,采用整合生物学研究策略,利用全转录组及单细胞转录组测序、蛋白组学分析、免疫荧光染色、WB、RIP等实验技术,以不同纬度(物种、品种、解剖部位)皮肤组织和细胞为研究材料,从分子、细胞、个体、群体等多方面开展以下研究(1)全转录组水平筛选鉴定调控成华猪独特皮厚性状形成的关键生物学通路;(2)单细胞转录组水平揭示成华猪皮肤不同解剖部位成纤维细胞的异质性和基因表达规律;(3)成华猪真皮成纤维细胞来源小细胞外囊泡调控成纤维细胞活性和I型胶原蛋白生物合成。通过研究,取得如下主要研究结果:1.组织形态学及生化指标揭示出成华猪独特皮厚性状的品种特征结果发现:(1)成华猪背后部真皮层厚度高达8.5 mm,而对照组大白猪仅为3.0mm;(2)成华猪皮肤中富含I型胶原蛋白(成华猪58.6 g/cm2 vs.大白猪21.8 g/cm2);(3)成华猪不同解剖部位真皮厚度存在明显差异(P<0.05),其背后部、头部、肩部、腿部、腹部和耳部真厚度依次递减。2.全转录组水平筛选鉴定出调控成华猪独特皮厚性状形成的关键生物www.selleck.cn/products/Gefitinib学通路通过对成华猪和大白猪背后部皮肤组织全转录组测序分析发现:(1)两品种间存在454个差异表达的m RNAs、612个差异表达的circ RNAs、188个差异表达的mi RNAs和19个差异表达的lnc RNAs,揭示出皮肤组织基因转录水平的品种特异性。(2)在差异表达基因中,以67个circ RNAs、47个mi RNAs和48个m RNAs构建出众多circ RNA-mi RNA-m RNA互作调控网络,其中筛选出高表达于成华猪皮肤组织中的circ004463介导的关键候选circ004463-mi R-23b-CADM3/MAP4K4调控轴。(3)在细胞和小鼠活体水平基因功能验证实验中,荧光素酶报告和免疫共沉淀(RIP)分析显示,circ004463靶向mi R-23b、而mi R-23b靶向基因是CADM3/MAP4K4;RT-q PCR和ELISA分析表明,过表达circ004463/CADM3/MAP4K4和mi R-23b inhibitor促进I型胶原蛋白生物合成;CCK-8和Ed U分析表明,过表达circ004463和mi R-23b inhibitor促进成纤维细胞增殖;α-SMA荧光染色分析显示,过表达circ004463促进成纤维细胞向成肌成纤维细胞转化;P21染色和WB分析显示,mi R-23b inhibitor减缓成纤维细胞凋亡。但是,干扰链circ004463/CADM3/MAP4K4和mi R-23b mimics呈现其相反实验结果。而且,过表达circ004463能增加小鼠皮肤厚度和I型胶原蛋白含量。此外,RT-q PCR、ELISA、WB等实验结果显示,circ004463、mi R-23b、CADM3/MAP4K4之间的共转染能显著影响彼此间的表达水平、成纤维细胞活性和I型胶原蛋白含量,且circ004463-mi R-23b-CADM3/MAP4K4调控轴是通过激活下游AKT/ERK信号通路来发挥其生物功能。以上研究结果显示,circ0044633-mi R-23b-CADM3/MAP4K4调控轴在成华猪独特皮厚性状形成过程中起关键调节作用。3.单细胞转录组水平揭示成华猪皮肤不同解剖部位成纤维细胞的异质性和基因表达规律利用单细胞转录组测序技术,对成华猪6个不同解剖部位(背后部、头部、肩部、腿部、腹部和耳部)和对照组大白猪背后部的皮肤组织样本进行单细胞转录组测序,结果如下:(1)构建出成华猪6个不同解剖部位和大白猪背后部皮肤组织单细胞转录组图谱,共获得233715个皮肤细胞,这包括成纤维细胞、平滑肌细胞及内皮细胞等7种细胞类型,并揭示出成纤维细胞的异质性。(2)基于不同品种和不同解剖部位皮肤组织分析,成华猪背后部成纤维细胞中与胶原蛋白合成关联基因表达水平显著上调,筛选出COL11A1、TNN和INHBA是影响成华猪独特皮厚性状形成的关键候选基因。(3)细胞通讯互作分析发现,COLLAGEN和LAMININ信号通路介导成纤维细胞与平滑肌细胞/表皮干细胞间的细胞交流。以上研究结果揭示出成华猪皮肤组织中单细胞转录表达信息,筛选出调控成华猪独特皮厚性状形成的关键候选基因,即COL11A1、TNN和INHBA基因。4.成华猪真皮成纤维细胞来源小细胞外囊泡促进成纤维细胞活性和I型胶原蛋白生物合成研究结果发现:(1)采用差速超速离心法、透射电镜、纳米颗粒示踪、流式细胞术等实验方法分离鉴定出成华猪和大白猪(对照组)真皮成纤维细胞来源小细胞外囊泡。(2)在细胞(成华猪、大白猪和人真皮成纤维细胞)和小鼠活体水平功能验证实验中,RT-q PCR和ELISA分析发现,来自成华猪真皮成纤维细胞来源小细胞外囊泡显著上调成纤维细胞中I型胶原蛋白的表达水平(P<0.05);CCK-8、Ed U和流式细胞术检测显示其促进成纤维细胞增殖功能;伤口愈合实验显示其促进成纤维细胞迁移功能;胶原凝胶收缩实验显示其刺激胶原凝胶收缩功能;小鼠皮下注射显示其增加小鼠皮肤厚度和I型胶原蛋白含量。上述结果表明,成华猪真皮成纤维细胞来源小细胞外囊泡能更高效的促进成纤维细胞活性。(2)对成华猪和大白猪真皮成纤维细胞来源小细胞外囊泡进行蛋白组学分析,共获得151个差异表达蛋白,筛选出调控成纤维细胞活性的关键候选ITGBL1蛋白分子。(3)在细胞和小鼠活体水平的功能验证实验中,RT-q PCR分析发现,过表达ITGBL1基因显著上调I型胶原蛋白的表达水平(P<0.05);Ed U和流式细胞术检测显示其促进成纤维细胞增殖;伤口愈合实验显示其促进成纤维细胞迁移;胶原凝胶收缩实验显示其刺激胶原凝胶收缩;WB实验显示,ITGBL1基因通过介导TGFβ-SMAD2/3信号通路发挥其生物功能。但是,干扰链ITGBL1呈现相反的实验效果。小鼠皮下注射实验显示,过表达ITGBL1能增加小鼠皮肤厚度和I型胶原蛋白含量。以上研究结果揭示,成华猪独特的皮厚性状赋予其自体真皮成纤维细胞来源小细胞外囊泡具有更高效地促进成纤维细胞活性和I型胶原蛋白合成的特性。综上所述,基于多组学分析和体内外功能验证实验,解析出成华猪独特皮厚性状形成的分子基础,这包括筛选鉴定出参与调控成纤维细胞活性、I型胶原蛋白含量和皮肤厚度的circ004463-mi R-23b-CADM3/MAP4K4关键调控轴、基于单细胞转录组水平挖掘出的与皮肤厚度形成关联的COL11A1、TNN和INHBA关键候选基因、以及富集于真皮成纤维细胞来源小细胞外囊泡中的ITGBL1活性分子。本论文研究结果对特色猪种皮厚性状的选育提高提供重要应用价值,也为人类皮肤生理健康研究提供重要理论参考。