牛病毒性腹泻(BVD)是一种全球分布的传染病,由牛病毒性腹泻病毒(BVDV)引起,该病毒为单股正链RNA病毒,主要感染牛、羊、猪及其它反刍动物。BVDV不仅引起高热、咳嗽、腹泻,母畜流产等临床症状,还会引起犊牛的持续感染(PI),导致免疫抑制。该病感染范围广、传播快、缺乏治疗方法,是养牛业重要防控的动物疫病之一。我国将BVDV列为二类传染病,世界动物卫生组织(WOAH)将其列为法定报告病因。BVDV每年给养牛业带来巨大的经济损失,因此控制BVDV感染对养牛业具有重要意义。免疫接种是预防BVDV感染的有效方法。为了防止母畜流产和持续感染动物的产生,对母牛及犊牛进行疫苗接种是最重要的。这需要使用安全性能高的灭活疫苗或亚单位疫苗。由于BVDV亚型多、变异快,灭活疫苗很难预防流行毒株的感染,且肌肉注射操作困难,而亚单位疫苗具有生产周期短,各亚型之间的优势蛋白可以融合表达的优点。因此,研发通过鼻腔雾化的方式接种具有中和活性的E2亚单位疫苗或许是更安全有效的方法。同时,建立E2阻断ELISA抗体检测方法有利于更好的监测疫苗效果。具体研究内容如下:1.BVDV E2、E2Ft、E2Fc基因的构建与蛋白的表达BVDV XZ02的E2基因序列登录号为MF278652,去掉跨膜区形成截短的E2构建BVDV E2、E2Ft、E2Fc真核表达质粒。纯化后得率为1-3mg/100m L。2.BVDV亚单位疫苗的免疫程序及效果评估将3种亚单位疫苗分别与IMS 1313VG佐剂(Seppic,法国)1:1乳化,使蛋白终浓度为200μg/m L,选择BVDV抗体阴性的2-4月龄犊牛35头,分别在试验第1d、第21 d、第35 d通过肌肉注射或鼻腔雾化的方式接种疫苗1m L。阳性对照使用BVDV灭活疫苗(华威特公司,中国)。第二次免疫后收集血清、粪便和鼻黏膜棉拭子,检测Ig A和SIg A的水平发现,血液中的Ig A含量在200-300pg/m L高于粘膜分泌的SIg A含量100-150pg/m L,鼻粘膜免疫组E2Fc的Ig A和SIg A水平都是最高(P<0.01),鼻粘膜免疫组E2Ft与E2的SIg A水平有差异(P<0.05)。免疫第49天黏膜免疫组E2Fc和E2Ft的CD4~+和CD8~+T细胞的比值均高于E2组,且两组中CD4~+均高于CD8~+,说明E2-Fc、E2Ft和灭活疫苗组比E2组诱导了更强的针对Th1型的BVDV特异性细胞免疫应答。淋巴细胞增殖实验证明,E2Fc免疫组和灭活疫苗组的淋巴细胞刺激指数最高(P<0.001)。在检测血清中IFN-γ、IL-2、IL-4水平时发现,粘膜免疫组E2Fc和E2Ft的IFN-γ、IL-2含量在150-250pg/m L之间,明显高于IL-4。说明粘膜免疫E2Fc亚单Regorafenib体内位疫苗能明显促进犊牛的Th1型细胞免疫反应。通过ELISA方法检测免疫E2、E2Ft和E2Fc亚单位疫苗后犊牛产生的特异性抗体。实验结果表明,E2Ft和E2Fc亚单位疫苗诱导的抗体水平明显高于E2组(P<0.001)。黏膜免疫组E2Ft和E2Fc的抗体水平高于肌肉注射组E2Ft和E2Fc,与灭活疫苗组没有明显差异。中和试验及牛肺泡巨噬细胞的激光共聚焦结果证明,FcγRI(Fc受体)跨越黏膜屏障转运E2Fc融合蛋白,FcγRI与E2Fc在牛巨噬细胞中定位在细胞质和细胞膜上,这种类似抗体结构的二聚体蛋白通过与受体的结合延长了其在体内的半衰期。E2Fc亚单位疫苗诱导的中和抗体达到1:64,其效果优于E2Ft亚单位疫苗,与肌肉注射的灭活疫苗效果相当。3.BVDV XZ02病毒单克隆抗体的制备利用纯化后灭活的BVDV-XZ02全病毒与佐剂共同乳化,免疫8周龄的雌性BALB/c小鼠,剂量为100μg/只,14天后2免,共免疫3次。腹腔冲击免疫300μL灭活病毒后3 d取小鼠脾脏进行细胞融合。用真核表达的E2蛋白为包被抗原3mg/m L,用间接ELISA筛选得到B6、F10、F11、H12、E8共5株针对E2蛋白的单克隆抗体。用亚型检测试剂盒鉴定5株单抗亚型均为Ig G1,轻链均为κ链。单抗相加实验证明各组AI值均<10%,说明5株单抗可能作用于相同的抗原表位。通过抗体阻断活性分析,5株单抗中B6的阻断率最高为87.68%,因此,辣根过氧化物酶标记B6(HRP-B6)用于后续阻断ELISA检测方法的摸索。4.BVDV E2阻断ELISA抗体检测方法的建立通过方阵滴定实验探索抗原(3 mg/m L)和HRP-B6(1.4 mg/m L)单抗最佳使用浓度为1:1000和1:10000,临界值为0.51,建立BVDV-E2阻断ELISA方法。对牛分枝杆菌、牛巴氏杆菌、牛结节疹、牛传染性鼻气管炎、牛口蹄疫,五种阳性血清检测无交叉反应;临床样本检测符合率为94.35%;阻断ELISA板内变异系数为2.93%,批间重复>15%,灵敏度为1:64。检测武汉和西藏地区317份临床血清样品,其中阳性样品118份,阴性样品179份。应用该方法从抗体阳性犊牛粪便中分离到1株BVDV-WH36病毒,鉴定为致细胞病变型(CP型)。综述所述,本研究通过HEK293悬浮培养细胞表达并纯化了BVDV-E2、BVDV-E2Ft和BVDV-E2Fc 3个重组融合蛋白,将其分别与1313VG佐剂混合制备成3种亚单位疫苗。通过黏膜免疫和肌肉注射两种途径来比较它们对犊牛的免疫效果,结果显示,不管是在黏膜免疫组还是肌肉注射组E2Fc亚单位疫苗的效果优于E2Ft及E2,而且黏膜免疫组整体水平高于肌肉注射组,证实E2Fc蛋白不仅诱导了Ig A的分泌,而且引起特异性T细胞免Blebbistatin体内疫反应和Th1型细胞免疫反应。E2Fc蛋白在牛肺泡巨噬细胞上与FcγRI结合实现了跨黏膜转运,延长了融合蛋白在体内的停留时间,促进特Soil remediation异性抗体的产生。进一步说明E2Fc疫苗通过鼻腔喷雾的粘膜免疫方式,提高了细胞免疫和体液免疫应答。此外,BVDV E2阻断ELISA抗体检测方法的建立,为BVDV疫苗的抗体监测提供有力保障。