随着现代遗传学的发展和母猪繁殖性能的提高,人工哺乳系统在商业化生猪生产中应用地越来越普遍。研究发现人工哺乳会造成腹泻高发,引起死亡率升高,严重危害仔猪的福利。粪菌移植是将健康供体粪便菌群移植到受体的肠道内,重塑受体的肠道菌群结构来治疗疾病。然而,粪菌移植能否缓解人工哺乳仔猪的腹泻仍有待进一步研究。因此,本试验以人工哺乳的仔猪为研究对象,主要从仔猪的生理指标和行为表达的角度出发,评估人工哺乳对仔猪福利状况的影响;运用16s r RNA和RNA-seq技术,阐明人工哺乳诱导仔猪腹泻的分子机制。通过移植母猪饲养仔猪的粪便菌群,探究粪菌移植对人工哺乳仔猪腹泻的缓解作用及其潜在机制。本研究有助于了解人工哺乳对仔猪福利水平和健康状况的影响,为粪菌移植作为缓解仔猪腹泻的可行方法提供了理论依据。第一部分:人工哺乳对仔猪生长性能和福利状况的影响本试验选择30头杜民母猪及其所产240头大杜民新生仔猪,随机分为3个组:对照组(CON组)、21日龄起人工哺乳组(AR21组)和7日龄起人工哺乳组(AR7组),试验期为36天。称量仔猪的体重,观察仔猪的正常行为(哺乳/吃奶、排便、探究、玩耍、争斗)和异常行为(拱腹、操纵同伴),评估泪痕面积,检测皮质醇浓度和免疫指标(Ig G、Ig A、CRP、IL-1β、IL-4、IL-6、IL-10和TNF-α)。试验结果显示:(1)人工哺乳仔猪的平均日增重和35日龄体重显著低于母猪哺乳的仔猪(P<0.05)。(2)在整个行为观察周期内,与母猪哺乳的仔猪相比,7日龄起人工哺乳仔猪的哺乳/吃奶、探究、玩耍行为更少(P<0.05),拱腹和操纵同伴行为更多(P<0.05);21日龄起人工哺乳仔猪的哺乳/吃奶、玩耍行为更少(P<0.05),拱腹行为更多(P<0.05)。(3)21日龄时,7日龄起人工哺乳的仔猪更倾向于在休息区排便。(4)人工哺乳仔猪的泪痕评分显著高于母猪哺乳的仔猪(P<0.05)。(5)与母猪哺乳的仔猪相比,7日龄起人工哺乳仔猪的皮质醇、CRP、IL-1β、IL-4、IL-6和TNF-α浓度显著升高(P<0.05),Ig G、Ig A和IL-10浓度显著降低(P<0.05);21日龄起人工哺乳仔猪的CRP、IL-4和IL-6浓度显著升高,IL-10浓度显著降低(P<0.05)。上述结果表明,7日龄和21日龄起人工哺乳都能引发仔猪应激,对生长性能、福利状况和免疫功能有负面影响。母猪的存在有助于仔猪更早地建立固定的排便区域。第二部分:人工哺乳诱导仔Nirmatrelvir使用方法猪腹泻的机制研究本试验从每组中随机选取10头仔猪,采集升结肠部内容物及粘膜样本,使用H&E染色和PAS染色观察结肠显微结构;使用16s r RNA测序检测结肠菌群;使用RNA-seq筛选差异表达基因,并用RT-q PCR和Western blot验证差异表达基因。试验结果显示:(1)人工哺乳仔猪的腹泻率显著高于母猪哺乳的仔猪(P<0.05)。(2)与母猪哺乳的仔猪相比,人工哺乳仔猪的结肠菌群的丰富度和多样性显著减少(P<0.05),菌群组成发生显著改变,碳水化合物代谢通路显著上调。(3)与母猪哺乳的仔猪相比,人工哺乳仔猪的结肠出现明显的显微结构变化,特别是白细胞浸润;7日龄起人工哺乳仔猪的结肠中杯状细胞数量显著减少(P<0.05)。(4)RNA-seq筛选到差异表达的紧密连接蛋白、NF-κB通路相关基因、细胞因子和SLC家族基因,这些基因显著富集到与炎症、免疫及营养物质消化吸收相关的信号通路。(5)与母猪哺乳的仔猪相比,人工哺乳仔猪的结肠中紧密连接蛋白ZO-1、Claudin-2和JEAP的表达显著降低(P<0.05);TLRs通路相关基因TNFSF11、TNF-α、IL-1β、TLR2、TLR4和My D88的表达显著增加(P<0.05),IL-1Ra的表达显著降低(P<0.05);NF-κB通路相关基因NF-κB、COX-2、PTGEs和i NOS的表达显著上调(P<0.05),IκBα的表达显著下调(P<0.05);细胞因子IL-2、IL-6、IL-17和IFN-γ的表达显著升高(P<0.05);SLC家族成员SLC51A、SLC51B、SLC9A3、SLC26A3和SLC2A5的表达显著降低(P<0.05)。上述结果表明,人工哺乳改变了仔猪结肠菌群,激活NF-κB通路,促进促炎症细胞因子的分泌,调节SLC家族的表达,影响溶质转运,增加了仔猪的腹泻率。第三部分:粪菌移植对仔猪生长性能和福利状况的影响本试验选择18头杜民母猪及其所产144头大杜民新生仔猪,随机分为3个组:对照组(CON组)、7日龄起人工哺乳组(AR组)和粪菌移植组(FMT组)。试验期为36天。选取健康且无特定病原体的仔猪作为试验供体,由母猪哺乳至断奶,收集粪便并制成粪菌胶囊。7日龄起,AR组和FMT组仔猪由人工饲喂代乳品。在1-11日龄,FMT组仔猪灌服粪菌胶囊。称量仔猪的体重,观察仔猪的正常行为(哺乳/吃奶、排便、探究、玩耍、争斗)和异常行为(拱腹、操纵同伴),检测皮质醇浓度。试验结果显示:(1)粪菌移植后,人工哺乳仔猪的日增重和35日龄体重显著提高(P<0.05)。(2)与人工哺乳的仔猪相比,粪菌移植组仔猪的哺乳/吃奶、探究、玩耍、拱腹和操纵同伴行为均无显著差异(P＞0.05)。(3)粪菌移植组仔猪的皮质醇浓度显著低于人工哺乳组仔猪(P<0.05)。上述结果表明,粪菌移植能提高人工哺乳仔猪的生长性能,在一定程度上改善仔猪的福利状况。第四部分:粪菌移植对仔猪肠道结构、菌群及免疫应答的影响本试验从每组中随机选取6头仔猪,采集升结肠部内容物及粘膜样本,使用H&E染色和PAS染色观察结肠显微结构;使用16s r RNA测序检测结肠菌群的改变;使用RNA-seq筛选差异表达基因,并用RT-q PCR和Western blot验证差异表达基因;使用非靶向代谢组学筛选肠道内容物中的差异代谢物。建立5-HIAA和LPS联合处理IPEC-J2细胞模型,使用CCK-8试剂盒检测细胞活力,使用RT-q PCR、Western blot和免疫荧光染色检测细胞中的紧密连接蛋白和细胞因子的表达水平。试验结果显示:(1)粪菌移植组仔猪的腹泻率显著低于人工哺乳组仔猪(P<0.05)。(2)粪菌移植改变了仔猪结肠菌群的组成,双歧杆菌属Bifidobacterium的相对丰度显著提高(P<Medication-assisted treatment0.05)。(3)粪菌移植显著改善了人工哺乳造成的结肠损伤,中性粒细胞减少。杯状细胞的数量和MUC2表达显著增加(P<0.05)。(4)差异表达基因显著富集到IL-17信号通路。(5)与人工哺乳的仔猪相比,粪菌移植组仔猪结肠中紧密连接蛋白ZO-1、Claudin-1、Claudin-4、Occludin和E-cadherin的表达显著提高(P<0.05);TLRs通路相关基因IL-1β、TNF-α、TLR2、TLR4的表达显著下调(P<0.05);JNK通路相关基因MEKK1、MEKK4、MKK4、MKK7、JNK1、JNK2、c-Jun和c-AZD2281细胞培养Fos的表达显著下调(P<0.05);细胞因子IL-6、IL-17和IFN-γ的表达显著降低(P<0.05),IL-2和IL-10的表达显著升高(P<0.05);趋化因子CXCL2、CXCL8、CXCL10和CCL2的表达显著降低(P<0.05);MMP家族成员MMP1、MMP9和MMP13的表达显著降低(P<0.05);CYP家族成员CYP1A1和CYP1B1的表达显著上调(P<0.05)。(6)非靶向代谢组分析表明差异代谢物显著富集到色氨酸代谢通路。(7)16s r RNA和非靶向代谢组联合分析表明Bifidobacterium与色氨酸代谢产物5-HIAA存在极显著正相关关系。(8)粪菌移植组仔猪结肠中5-HT和5-HIAA浓度显著高于非粪菌移植组仔猪(P<0.05)。(9)在IPEC-J2细胞中,5-HIAA能缓解LPS诱导的炎症反应,表现为细胞活力显著增加(P<0.05),CYP1A1和CYP1B1的表达显著提高(P<0.05);紧密连接蛋白Claudin-1、Claudin-4、Occludin和E-Cadherin的表达增加(P<0.05);细胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-17的表达降低,IL-10的表达增加(P<0.05)。上述结果表明,粪菌移植能改变人工哺乳仔猪的结肠菌群组成及其代谢产物,促进色氨酸代谢和5-HIAA的产生,增强肠粘膜屏障功能,抑制JNK通路的活化和MMPs的表达,减少促炎症细胞因子和趋化因子的分泌,缓解人工哺乳造成的仔猪腹泻。