目的:临床案例充分证明补脾益肠丸(BPYCP)有效治疗溃疡性结肠炎(UC),然其作用机制不明。UC临床上反复发作、难以彻底治愈,CD4~+T细胞介导的免疫记忆在UC维持和缓解中扮演关键性角色,而瘦素受体(LepR)信号介导的能量代谢调控记忆性CD4~+T细胞的分化及效应功能。靶向干预能量代谢调控其免疫反应是治疗自身性免疫疾病的新兴策略。因此,我们基于LepR信号介导的记忆性CD4~+T细胞稳态探究BPYCP治疗UC的作用机制。方法:(1)BPYCP抑制DSS诱导的实验性结肠炎:液相色谱-质谱联用检测BPYCP的物质成分,高效液相色谱检测BPYCP中补骨脂素、异补骨脂素、芍药苷的含量;葡聚糖硫酸钠(DSS)自由饮水法诱导C57BL/6小鼠实验性结肠炎,BPYCP同步给药,整个试验期内小鼠称重,观察小鼠临床症状,疾病活动指数=小鼠体重下降率评分+粪便粘稠度评分+便血评分,病理组织技术检测结肠组织损伤;Elisa法检测结肠组织促炎性细胞因子IL-6、IL-17A、TNF-ɑ及抗炎性细胞因子IL-10的浓度;生化法检测结肠组织氧化应激指标CAT、GSH-Px、SOD、MDA。(2)BPYCP重塑记忆性T细胞稳态治疗小鼠实验性结肠炎作用机制:流式细胞术检测Na(?)ve、TCM、TEM细胞及其CD4、CD8亚群,Elisa法检测记忆性T细胞分化的细胞因子IL-7、IL-15、IL-21表达水平,流式细胞术进一步检测TCM、TEM细胞亚群水平。(3)BPYCP通过调节Notch信号重塑结肠炎小鼠Th17/Treg细胞平衡治疗实验性结肠炎的作用机制:在明确BPYCP对小鼠实验性结肠炎疗效的基础上,流式细胞术检测Th17/Treg细胞百分比,Elisa法检测IL-17A/IL-10浓度,q PCR法检测IL-17A、AHR、BATF、RORɑ、RORγt、IL-10、Foxp3、Eomes,q PCR和WB检测DLL1、DLL4、Jagged1、Jagged2、Notch1、Notch2、Notch3、Hes1、Hes5基因蛋白表达水平,流式细胞术检测Th17/Treg细胞Notch1表达水平。(4)BPYCP调节滤泡辅助性T细胞(Tfh)稳态治疗小鼠实验性结肠炎作用机制研究:流式细胞术检测Tfh、Tfh亚群及记忆性Tfh细胞水平。ELISA、Western blotting、q PCR检测炎性细胞因子、Tfh细胞相关生物标志物的表达水平。(5)BPYCP调节CD4~+TEM细胞稳态治疗UC作用机制研究:流式分选CD4~+Na(?)ve T细胞,CCK8法评价BPYCP对其安全性及其IC50;流式分选CD4~+TEM细胞,获得性转移诱导结肠炎,BPYCP同步给药;流式细胞术、Elisa法检测CD4~+TCM、CD4~+TEM细胞促炎性细胞因子TNF-ɑ、IFN-γ、IL-17A,Annexin V-FITC/PI法检测记忆性CD4~+T细胞凋亡,Ki67检测其增殖。(6)干预LepR信号研究BPYCP治疗UC的作用机制:流式细胞术、WB、q PCR检测CD4~+T细胞LepR信号分子表达水平;q PCR和WB检测Glut1、Glut2、Glut4、HK2、Pfkm、PEPCK2、Aldolase A和PKM2基因蛋白水平;DSS诱导DB(LepR基因敲除)小鼠实验性结肠炎,BPYCP同步给药;流式细胞术检测Na(?)ve、TCM、TEM细胞及其CD4、CD8亚群;16S r RNA技术检测小鼠肠道菌群的多样性及丰度。(7)干预LepR信号研究BPYCP调控CD4~+TEM细胞稳态治疗UC作用机制:q PCR检测CD4~+TEM细胞LepR、Glut1、HIF-1ɑ的m RNA水平;CD4~+TEM~(ΔLepR)细胞获得性转移诱导的结肠炎,BPYCP同步给药;清除肠道菌群后,CD4~+TEM~(ΔLepR)细胞再获得性转移诱导的结肠炎,BPYCP同步给药;流式细胞术检测CD4~+TEM~(ΔLepR)细胞分泌细胞因子TNF-ɑ、IFN-γ、IL-17A,Annexin V-FITC/PI法检测CD4~+TEM~(ΔLepR)细胞凋亡,Ki67检测其增殖。结果:(1)BPYCP抑制DSS诱导的实验性结肠炎:BPYCP中的补骨脂素、异补骨脂素、芍药苷含量依次为2.13、1.62、31.41 ng/μL;BPYCP有效缓解DSS诱导结肠炎小鼠UC临床症状,伴随着体重损失、腹泻、便血等症状明显改善;与此同时,BPYCP有效抑制结肠炎小鼠结肠缩短、增重,结肠黏膜溃疡形成及大量炎性细胞浸润明显减少,其病理组织损伤评分亦显著降低;中剂量BPYCP处理的结肠炎小鼠结肠组织中促炎性细胞因子IL-17A、IL-6、TNF-α浓度明显下降,而抗炎性细胞因子IL-10显著上升;此外,中、高剂量BPYCP显著上调结肠炎小鼠结肠组织中CAT、GSH-Px、SOD水平,而显著下调MDA。(2)BPYCP重塑记忆性T细胞稳态治疗小鼠实验性结肠炎作用机制:与未处理的结肠炎小鼠相比,BPYCP处理的结肠炎小鼠肠系膜淋巴结中Na(?)ve(CD45RA~+CD62L~+CCR7~+)、CD4~+Na(?)ve(CD4~+CD45RA~+CD62L~+CCR7~+)、CD8~+Na(?)ve(liver pathologiesCD8~+CD45RA~+CD62L~+CCR7~+)、CD8~+TCM(CD8~+CD45RA~-CD62L~+CCR7~+)细胞的百分比均显著上升,而TCM(CD45RA~-CD62L~+CCR7~+)、CD4~+TCM(CD4~+CD45RA~-CD62L~+CCR7~+)、TEM(CD45RA~-CD62L~-CCR7~-)、CD4~+TEM(CD4~+CD45RA~-CD62L~-CCR7~-)和CD8~+TEM(CD8~+CD45RA~-CD62L~-CCR7~-)细胞百分比均显著下降,呈剂量依赖性;与此同时,BPYCP处理的结肠炎小鼠结肠组织中细胞因子IL-7、IL-15、IL-21浓度均显著下降;此外,DSS+BPYCP组结肠炎小鼠肠系膜淋巴结中TCM-Th17(CD45~+CD45RA~-CCR7~+IL-17A~+)、TCM-Tfh(CD45~+CD45RA~-CCR7~+CXCR5~+)、TEM-Th17(CD45~+CD45RA~-CCR7~-IL-17A~+)、TEM-Tfh(CD45~+CD45RA~-CCR7~-CXCR5~+)百分比显著低于DSS组,而TCM-Treg(CD45~+CD45RA~-CCR7~+IL-10~+)、TEM(CD45~+CD45RA~-CCR7~-IL-10~+-Treg)细胞的百分比都显著性下降。(3)BPYCP通过调节Notch信号重塑结肠炎小鼠Th17/Treg细胞平衡治疗实验性结肠炎的作用机制:中、高剂量BPYCP显著抑制结肠炎小鼠Th17细胞反应,肠系膜淋巴结中CD4~+CCR6~+、CD4~+IL-17A~+Th17细胞及其转录调控因子(AHR,BATF,RORɑ和RORγt)、细胞因子IL-17A表达水平均显著下降;与之相反,中、高剂量BPYCP显著增强结肠炎小鼠Treg细胞功能,肠系膜淋巴结中CD4~+CD25~+、CD4~+CD25~+Foxp3~+、CD4~+IL-10~+Treg细胞及其转录调控因子(Eomes,Foxp3)、细胞因子IL-10表达水平均显著上升;此外,BPYCP抑制结肠炎小鼠Notch信号活化,结肠组织中DLL1、DLL4、Jagged1、Jagged2、Notch1、Notch2和Hes1基因蛋白表达水平显著下降;相关性分析进一步发现Notch1基因水平与Th17细胞呈正相关,而与Treg细胞呈负相关,且BPYCP有效逆转了Th17和Treg细胞的Notch1表达。(4)BPYCP调节滤泡辅助性T细胞(Tfh)稳态治疗小鼠实验性结肠炎作用机制研究:BPYCP给药后显著降低结肠炎小鼠肠系膜淋巴结中的CD4~+CXCR5~+Tfh细胞百分比,及Tfh标志物CXCR5、IL-21、ICOS、PD-1、Bcl-6的表达。此外,BPYCP处理后明显降低结肠炎小鼠CD4~+CXCR5~+CXCR3~+Tfh1、CD4~+CXCR5~+CCR6~+Tfh17、CD4~+CXCR5~+CCR7~-Tem-Tfh细胞百分比,而显著上调CD4~+CXCR5~+Foxp3~+Tfr细胞。(5)BPYCP调节CD4~+TEM细胞稳态治疗UC作用机制研究:BPYCP对CD4~+Na(?)ve T细胞的IC50=90.53 mg/m L,安全性剂量为0～10.0 mg/m L;BPYCP显著上调CD4~+TEM细胞获得性转移诱导的结肠炎小鼠体重变化率、结肠长度,并显著下调DAI、结肠重量、结肠重量/结肠长度;与此同时,BPYCP有效改善结肠炎小鼠结肠组织黏膜完整,黏膜溃疡及炎性细胞浸润程度明显减轻,其病理组织损伤评分显著下调;BPYCP显著下调CD4~+TEM细胞分泌的TNF-ɑ、IFN-γ、IL-17A,且TNF-ɑ~+CD4~+TEM、IFN-γ~+CD4~+TEM、IL-17A~+CD4~+TEM、TNF-ɑ~+CD4~+TCM、IFN-γ~+CD4~+TCM、IL-17A~+CD4~+TCM细胞百分比亦显著性下降;此外,BPYCP处理的LPS刺激CD4~+TEM细胞Ceralasertib的凋亡率显著上升,而增殖率显著下降。(6)干预LepR信号研究BPYCP治疗UC的作用机制:DSS+BPYCP组的结肠炎小鼠CD45~+CD4~+LepR~+T细胞百分比及结肠组织中Leptin、LepR、HIF-1ɑ蛋白及基因水平均显著低于DSS组;DSS+BPYCP组Glut1、Glut2、Glut4、HK2、Aldolase A和PKM2的m RNA水平均显著低于DSS组,且Glut1、Glut2、Glut4、HK2、Aldolase A、PKM2蛋白水平均显著下降;2%、3%DSS诱导DB小鼠结肠炎死亡率100%,而1.5%DSS能够成功诱导DB小鼠实验性结肠炎,表现典型UC临床症状,体重下降、腹泻、便秘,结肠缩短、增重,结肠黏膜溃疡形成及大量炎性细胞浸润;BPYCP显著上调结肠炎DB小鼠体重、生存率、结肠长度,而显著下调DAI、便血分数、结肠重量/结肠长度;与此同时,BPYCP有效改善结肠炎DB小鼠结肠黏膜完整、抑制溃疡形成及炎性细胞浸润;BPYCP仅对结肠炎DB小鼠记忆性CD8~+T细胞具有调控作用,而对CD4~+亚群并没有显著调节作用;Ace和Chao指数显示在OTU水平上DB+DSS组低于DB、DB+DSS+BPYCP组,Venn图分析DB、DB+DSS、DB+DSS+BPYCP、DB+BPYCP组OTU数目分别是456、424、456、459;NMDS分析发现这四组肠道菌群是分离的,且存在显著性差异(Stress=0.139,P=0.00100),DB组与DB+DSS组的距离是大于DB+DSS组与DB+DSS+BPYCP组的距离;在属水平上Wilcoxon秩和检验发现DB+DSS+BPYCP组结肠炎DB小鼠的Candidatus＿Saccharimonas、Monoglobus的相对丰度显著低于DB+DSS组;回归分析发现CD4~+TCM(R~2=0.0113,P=0.6212)、CD4~+TEM(R~2=0.0238,P=0.4718)细胞与Shannon指数无明显相关性。(7)干预LepR信号研究BPMLN8237YCP调控CD4~+TEM细胞稳态治疗UC作用机制:BPYCP显著下调CD4~+TEM细胞LepR、Glut1、HIF-1ɑ的m RNA水平;BPYCP处理后,CD4~+TEM~(ΔLepR)细胞获得性转移诱导的结肠炎小鼠体重变化率、结肠长度显著上升,DAI、结肠重量、结肠重量/结肠长度均显著下降,结肠组织黏膜较完整、溃疡形成及炎性细胞浸润明显减少;清除肠道菌群后,BPYCP处理后的CD4~+TEM~(ΔLepR)细胞获得性转移诱导的结肠炎小鼠体重变化率、DAI、结肠长度、结肠重量、结肠重量/结肠长度无显著性作用,且结肠组织依然能观察到明显得溃疡形成及炎性细胞浸润;此外,BPYCP处理后,CD4~+TEM~(ΔLepR)细胞分泌细胞因子TNF-ɑ、IFN-γ、IL-17A及其凋亡率和增殖率均无显著性变化。结论:BPYCP有效缓解实验性结肠炎,其疗效与5-ASA相当;其抗UC的关键作用机制是BPYCP通过抑制LepR信号重塑记忆性CD4~+T细胞稳态,具体是通过调节记忆性T细胞分化,抑制Th17、Tfh细胞反应,促进Treg细胞反应,依赖LepR信号抑制记忆性CD4~+T细胞炎性分化及增殖、诱导其凋亡所实现的。本研究揭示BPYCP抗UC的关键靶点,为BPYCP临床治疗UC提供科学依据,为中医药防治自身性免疫疾病提供新的有效思路与策略。