背景及目的在目前真菌性角膜炎(Fungal keratitis,FK)的治疗中,由于缺乏有效的抗真菌药物,常常使得患者的治疗效果欠佳。丝状真菌,如腐皮镰孢菌和烟曲霉菌,是我国FK最常见的致病真菌。在我们的前期研究中,建立了腐皮镰孢菌角膜炎小鼠模型,我们发现在去除血小板后真菌感染部位的中性粒细胞募集减少;同时在体外实验中也发现真菌诱导角膜上皮细胞AMP依赖的蛋白激酶磷酸化增强,引起前炎症因子IL-6升高;血小板可促进中性粒细胞吞噬真菌、抑制真菌菌丝生长。因此,本研究旨在通过体外模拟角膜部位中性粒细胞向真菌部位的趋化,检测血小板是否在腐皮镰孢菌刺激下对中性粒细胞趋化产生影响,并明确血小板促进中性粒细胞向腐皮镰孢菌迁移的机制,为更好地治疗FK提供新思路。方法自人的外周静脉全血中提取中性粒细胞及血小板;人永生化角膜上皮系,37℃,5%CO_2环境中培养传代,胰酶消化后备用;从马铃薯葡萄糖琼脂培养基中培养的腐皮镰孢菌标准菌株中提取孢子备用。为研究在角膜上皮环境中,血小板在腐皮镰孢菌孢子刺激下对中性粒细胞趋化的影响,通过Transwell迁移实验进行中性粒细胞迁移能力检测,将细胞分为角膜上皮细胞(Corneal epithelial cell)组(CE组)、血小板组(P组)、角膜上皮细胞+孢子(Spore)组(CE+S组)、角膜上皮细胞+血小板组(CE+P组)、角膜上皮细胞+孢子+血小板(Platelet)组(CE+S+P组)及单纯培养基组(Control组,对照组)。将人角膜上皮接种至24孔板中贴壁4 h;按照比例及分组将孢子及血小板加入孔板;37℃,5%CO_2培养箱环境中培养2 h;收集它们的培养液离心;取离心后的上清液加入transwell板下室中;上室内按照比例每孔均接种等量pain medicine中性粒细胞;transwell板放置于37℃,5%CO_2培养箱中使中性粒细胞迁移30 min;使用倒置显微镜对迁移至小室下腔的中性粒细胞拍照,每孔选取6个视野,中性粒细胞迁移量通过软件Image J进行计数。为进一步明确炎症状态下,血小板对中性粒细胞表面细胞粘附因子和模式识别受体表达产生的影响,将细胞分为3组:中性粒细胞(Neutrophils)组(N组)、中性粒细胞+孢子组(N+S组)及中性粒细胞+孢子+血小板组(N+S+P组),在37℃,5%CO_2培养箱环境中共同培养。通过免疫荧光及流式细胞术检测中性粒细胞表达黏附因子:P-选择素糖蛋白配体-1(P-selectin glycoprotein ligand1,PSGL-1/CD162)、L-选择素(L-selectin,CD62L)、MK-2206核磁半乳糖凝集素-3(Galectin-3,一种β-半乳糖苷结合蛋白)和模式识别受体:树突状细胞相关的C型凝集素-2(Dendritic cell-associated C-type lectin-2,Dectin-2)、巨噬细胞诱导的C型凝集素(Macrophage-inducible C-type lectin,Mincle)的荧光强度;通过Image J统计中性粒细胞表达PSGL-1、CD62L、galectin-3、Dectin-2、Mincle的平均荧光强度。结果中性粒细胞的迁移结果显示,培养30 min后,CE+S+P组的中性粒细胞向下室迁移量与Control组、CE组、CE+S组、CE+P组及P组相比明显增加,差异有统计学意义(P<0.05),Control组、CE组、CE+S组、CE+P组及P组的中性粒细胞迁移量未见明显差异,无统计学意义(P>0.05)。血小板促进中性粒细胞表面粘附因子表达变化。免疫荧光染色结果示,共培养15min后,在N组中,PSGL-1、CD62L荧光低水平表达,而在加入孢子和血小板后(N+S+P组),PSGL-1、CD62L荧光强度明显增强,高于N组与N+S组(P值均<0.001);在共培养5 min后,中性粒细胞表面Galectin-3表达荧光强度在N组较低,孢子加入(N+S组)并未引起其荧光强度变化(P>0.05),但是血小板和孢子(N+S+P组)的共同刺激下,Galectin-3荧光强度明显高于N组和N+S组(P<0.05)。流式检测进一步证实以上结果:共培养15 min后,N组中性粒细胞表面PSGL-1低表达,孢子的加入引起中性粒细胞表面荧光强度的变化(P<0.001),而P的加入(N+S+P组),明显增进PSGL-1表达的荧光强度,高于N组及N+S组,差异有统计学意义(P<0.001);体外共培养7 min后,与N组相比,N+S组无明显变化(P>0.05),血小板促进中性粒细胞表面CD62L表达明显高于N组与N+S组(P<0.05);共培养2 min后,N+S+P组中性粒细胞表面galectin-3表达高于N组及N+S组,差异有统计学意义(P<0.05),而N组与N+S组无明显差异。血小板促进中性粒细胞表面模式识别受体表达变化。加入血小板体外共同反应15min时,免疫荧光结果显示,中性粒细胞在腐皮镰孢菌孢子刺激下表达Dectin-2荧光强度相比N组及N+S组明显增加,差异有统计学意义(P<0.01);流式细胞术检测显示相似结果:体外共同反应5 min后,N+S+P组中性粒细胞表面Dectin-2表达高于N+S组,差异有统计学意义(P<0.01);加入血小板体外共同反应5 min时,免疫荧光结果显示,中性粒细胞在腐皮镰孢菌孢子刺激下表达Mincle荧光强度相比N组及N+S组明显增加,差异有统计学意义(P<0.05);体外共同反应2 min后,通过流式细胞术检测发现N+S+P组中性粒细胞表面Mincle表达高于N+S组,差异有统计学意义(P<0.05);结论真菌感染时,获悉更多血小板刺激中性粒细胞黏附因子PSGL-1、CD62L、galectin-3表达引起中性粒细胞及血小板聚集的级联反应,促使中性粒细胞向内皮细胞的迁移、黏附;进入真菌感染部位后,血小板可诱导中性粒细胞模式识别受体Mincle、Dectin-2和黏附因子galectin-3的表达,增强中性粒细胞对真菌病原体的识别,促进中性粒细胞向真菌部位迁移。