研究目的:通过体外试管实验和细胞水平探究不同浓度油菜蜂花粉多肽(BPARP)的抗氧化性以及对细胞缺氧损伤的保护作用。研究方法:1)样品分组:BPARP样品分为空白对照组和乳酸菌发酵组。空白对照组即未破壁花粉,乳酸菌发酵组对花粉进行破壁处理。2)细胞培养:选用HUVEC人脐静脉内皮细胞,培养于在添加15%胎牛血清、1%链霉素和青霉素的低糖DMEM培养基中,放置在含5%CO_2的37℃恒温恒湿培养箱中。3)DPPH清除能力的测定:取200μl蛋白浓度为8、16、32、64、128μg/ml的样品与试管中,加入2ml浓度为0.2mmol/L的DPPH,混匀,室温避光反应30分钟,在波长为517nm处测定样品吸光度。空白组:样品溶液100μL+无水乙醇100μL;样品组:样品溶液100μL+DPPH醇溶液100μL;对照组:DPPH醇溶液100μL+水100μL。清除率(%)=(A_空-A_样)/A_对*100%其中,A空表示空白组在517nm处的吸光度,A样表示样品组在517nm处的吸光度,A对表示对照组在517nm处的吸光度。4)氧化损伤模型制作:将细胞按照10,000个细胞/孔的密度接种于96孔板中,每孔100μl,放置于培养箱培养24h,将5个浓度梯度的1000μM到1μM的氯化钴(Co Cl2)加样于96孔板中,每孔100μl,并培养24小时。5)MTT法测细胞活力:MTT法的检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为蓝紫色结晶甲臢并沉积在细胞中。甲臜不溶于水溶解于二甲亚砜。吸除原培养基,每孔加入90μl预热的培养基和10μl噻唑蓝(MTT,5mg/ml),置于培养箱中作用3h。吸除MTT溶液,每孔加入150μl二甲基亚砜溶液(DMSO),置于摇床上避光作用30 min。用酶标仪测定570 nm波长下的吸光度,吸光度genetic disoders值与细胞活力呈正比,吸光度值越大,细胞活力越高。6)油菜蜂花粉发酵物的添加:将细胞按照10,000个细胞/孔的密度接种于96孔板中,每孔100μL,放置于培养箱培养24h。将5个浓度梯度的1000μg/m L到1.6μg/mL油菜蜂花粉发酵物加样于96孔板中,每孔100μL,并分别培养6、12、24、48、72小时。吸除原培养基,每孔加入培养基配置的最佳浓度的Co Cl2置于培养箱中作用24 h。7)数据分析:数据分析选用graphpad prism 8.0版本,细胞活性作8个平行,结果显示为平均值和均数标准差(X±SD),作单因素方差分析比较。P<0.05被认为具有统计学意义。研究结果:1)BPARP清除DPPH自由基能力。在蛋白浓度为8-32μg/ml时,未发酵的空白对照组样品清除DPPH自由基能力www.selleck.cn/products/Gefitinib比发酵组弱,当蛋白浓度高于64μg/ml时,空白对照组样品清除DPPH自由基的能力高于发酵组,但在任何浓度下,两组对清除DPPH自由基的能力无显著性差异(P>0.05)。两组对DPPH自由基的抑制率均随着蛋白浓度的增加而提高,说明BPARP蛋白浓度越高,清除DPPH自由基能力逐渐增强。2)Co Cl2浓度的确定。以空白(0μM)的细胞活力为100%来看,1000μM的细胞活力为45.643.81%,800μM细胞活力为48.963.31%,600μg/ml的细胞活力为52.952.54%,12.5μg/ml与25μg/ml比较,100μg/ml与200μg/ml比较,400μg/ml与600μg/ml比较均p0.05。其余各项比较均无显著性差异。Co Cl2浓度过高或过低都会影响模型的准确性。Co Cl2浓度过高会导致细胞活力很低,而Co Cl2浓度过低则达不到引起细胞氧化应激状态的效果,本实验选择Co Cl2浓度为200μg/ml,细胞活力为71.955.88%,是空白对照组的大约80%左右。3)油菜蜂花粉发酵物对细胞活力的影响。细胞活力即活细胞占总细胞的百分比。细胞活力作为研究抗氧化指标可以直观地反应BPARP对正常细胞和氧化损伤细胞的存活能力的影响。对于种96孔板的细胞加入不同浓度的BPARP。通过细胞对BPARP的吸收PEG300 MW利用,研究对于BPARP对于细胞活性下降的改善作用。低浓度BPARP对细胞活力没有明显的影响。当BPARP浓度为1.6μg/ml时,对缺氧损伤细胞具有改善作用,随着BPARP浓度的不断增加,HUVEC细胞活力越来越高。在这5个浓度下,乳酸菌发酵组的细胞活力显著均高于空白对照组(P<0.05),对细胞缺氧状态改善效果显著。研究结论:本实验得出BPARP具有一定的抗氧化作用,以及对细胞缺氧损伤起到保护作用,且浓度越大效果越明显。