牦牛LC3B蛋白多克隆抗体制备及在生殖器官表达检测中的应用

本研究旨在克隆牦牛微管相关蛋白1轻链3B（microtubule associated protein 1 light chainBiocompatible composite 3B， LC3B）基因，制备牦牛LC3B多克隆抗体，为探究自噬在牦牛生殖生理过程中的作用奠定基础。通过基因克隆方法获得牦牛LC3BMS-907351 IC50B基因序列，利用原核表达、亲和层析法纯化牦牛LC3B重组蛋白，使用纯化的蛋白为抗原免疫10月龄日本大耳白兔，SephaSCH772984浓度rose4B柱层析法纯化制备牦牛LC3B多克隆抗体，利用酶联免疫吸附测定（ELISA）测定抗体效价，并使用蛋白质免疫印迹（WB）、免疫组织化学法（IHC）和免疫荧光技术（IF）检测牦牛生殖器官中LC3B蛋白的表达。结果显示，本研究成功克隆出牦牛LC3B基因（登录号：OP572227），构建的重组质粒pET-32a-LC3B能够诱导产生重组蛋白，并且在包涵体和上清中均有表达；所纯化出的牦牛LC3B重组蛋白大小为34 kDa（含Trx和His标签），符合预期结果。通过免疫日本大耳兔后得到的兔抗牦牛LC3B蛋白血清，抗体效价分别为1:640 000和1:320 000，特异性良好，表明牦牛LC3B蛋白多克隆抗体制备成功。纯化后的抗体应用于牦牛生殖器官中LC3B的表达检测，LC3B在牦牛卵巢、输卵管和子宫中表达，并且能识别LC3B-I和发生脂化后的LC3B-II，主要表达于细胞质及细胞核周。本研究通过成功克隆牦牛LC3B基因制备了牦牛LC3B多克隆抗体，使用抗体检测发现LC3B蛋白在牦牛生殖器官中均有表达，表明所制备的多克隆抗体特异性良好，能够应用于牦牛LC3B蛋白的检测和细胞自噬水平的研究。