黄热病毒家族的寨卡病毒(ZikaVirus,ZIKV)由于导致人类神经系统疾病如小头畸形和Guillain-Barré综合征等而受到广泛关注。寨卡病毒是一种单链正义RNA病毒,其RNA基因组编码的非结构蛋白3(NS3)包含一个蛋白酶结构域和一个解旋酶结构域,N端丝氨酸蛋白酶结构域需要与NS2B蛋白因子相互作用才能发挥活性;C端解旋酶结构域在核糖核苷三磷酸(Nucleoside triphosphate,NTP)结合、水解和RNA解旋、复制过程中起关键作用,利用NTP水解产生的能量解开双链RNA。这两者在病毒生命周期中发挥着重要作用,是研发抗寨卡病毒药物的重要靶标。黄病毒NS3解旋酶发挥NTP水解酶活性需要二价金属离子的介导。由于缺少无金属离子介导,与NTP结合NS3解旋酶处于预激活状态的结构信息,我们对金属离子诱导的NTP配体和Walker motif构象变化的分子机制了解甚少。本文研究获得的 5 个结构 NS3hapo、NS3h-GTPγS、NS3h-MgGTPγS、NS3h-MnATP2-(VO4)、NS3h-MnADP-阐明了二价金属离子激活 ZIKV NS3 解旋酶的结构基础。获得了第一个无金属离子介导,与NTP结合NS3解旋酶处于预激活状态的结构;这个不含金属离子的NS3h-GTPγS复合物的结构(NS3解旋酶处于激活前的状态)揭示GTP配体采用紧凑构象,减少与核苷酸结合袋的相互作用。NS3h-MgGTPγS复合物结构(NS3解旋酶处于活化态构型)揭示二价金属离子的结合下,GTP配体处于延展构象,Walker A motif经历了显著的构象变化,大大增加核苷三磷酸和NTP结合口袋的相互作用,使活化的水分子更易对其发生亲核攻击,促进γ磷酸根的裂解。ZIKVNS3helicaseapo结构,无金属离子结合NS3h-GTPγS 结构以及金属离子结合 NS3h-MgGTPγS、NS3h-MnATP2-(VO4)、NS3h-MnADP-结构比较和分析揭示了核苷酸结合、金属的结合和NTPs水解的动力学机制,确定了二价金属离子在促进NTP结合和局部结构重排中的变构调节作用,这一机制可能也适用于其他黄病毒NS3解旋酶。ZIKVNS3具有3′-5’的RNA解旋酶活性。先前研究表明其的固有解旋酶活性较弱,无法解旋20个碱基对的RNA双链体。ZIKVNS3不能单独有效地解旋ZIKV RNA基因组,如何将其解旋酶活性提高到病毒基因组复制所需的水平尚待研究;NS3的两种酶活性(即蛋白酶和解旋酶)PEG300核磁对于病毒组装和复制是必不可少的,但目前尚不清楚这两个具有不同功能的结构域是否会相互影响。本文使用光学镊子在单分子水平上表征ZIKVNS3的RNA展开特性selleckchem BMS-907351,包括其持续解旋能力、解旋速度和步长。使用光学镊子在施加于RNA底物末端不同作用力和不同ATP浓度下探究了 NS3的RNA解链活性,实时监测ZIKVNS3解旋RNA。实验证实全长ZIKV NS3蛋Competency-based medical education白具有ATP依赖的RNA解旋酶活性,削弱底物稳定性的外力显著增强了 NS3解旋酶活性:将皮牛力应用于RNA底物末端会增加全长NS3蛋白解旋速度和RNA持续解旋长度,催化活性提高了～3倍;ZIKV全长NS3蛋白在每个循环中的RNA持续解旋能力非常有限,NS3可能会向后滑移或从RNA链上解离或发生链反转,这解释了为什么在bulkassay中观察到NS3不能够高效发挥RNA解旋活性。比对NS3解旋酶结构域和NS3全长蛋白的RNA解旋活性,结果表明ZIKVNS3蛋白酶结构域的缺失对解旋酶活性没有显著的影响。此外,本研究表明ATP协调NS3解旋的循环运动中,NS3解旋酶的离散步骤为3个碱基对。本课题的结构研究为黄病毒家族NS3解旋酶和其他家族解旋酶中的二价金属依赖性构象变化和核苷酸水解提供了结构性解释,发现的抑制性NTP紧凑构象为治疗ZIKV感染的小分子抑制剂的合理药物设计提供了准确的信息。单分子水平研究揭示机械调节可能是激活NS3体内解旋活性的手段。在病毒基因组复制时,NS3的RNA解链活性可以由RNA依赖的RNA聚合酶(NS5)提供的力来调节,该复制复合物可以有效地解旋ZIKV基因组。这项研究让我们对这个在寨卡病毒复制装配过程中起关键作用的NS3有了更清晰的认识。黄病毒家族的解旋酶序列高度保守,NS3解旋酶在病毒复制的背景下按需激活,这种模式可以推广到其他黄病毒。