淡水鱼,营养Blue biotechnology物质丰富,作为优质蛋白质来源,深受消费者喜爱。随着人们生活节奏的加快和冷链物流的发展,消费者对于冷鲜鱼肉的需求逐年增长。鱼肉因其水分含量和内源酶活性较高,冷藏过程中易发生肌肉降解,引起不同程度的质构劣化。目前,国内外学者对肌原纤维蛋白在淡水鱼肉质构劣化中的作用开展了大量研究,但劣化机制仍不明确。结缔组织包括肌内膜(endomysium)、肌束膜(perimysium)和肌外膜(epimysium),分别包裹肌纤维、肌纤维束和肌肉,尽管其在含量上远低于肌原纤维,但是它在维持肌肉的完整性和机械性能上发挥了重要作用。胶原蛋白作为结缔组织的主要成分,其在冷鲜淡水鱼肉质构劣化中的作用和机制尚不清楚。本研究以草鱼为对象,阐明了冷藏鱼肉质构劣化与胶原蛋白变化的关系,解析了参与胶原蛋白降解的内源性蛋白酶(胶原降解酶)活性变化与冷藏鱼肉中胶原蛋白降解的关系,在此基础上分离和鉴定了对胶原蛋白降解起关键作用的内源酶,并从分子水平揭示胶原蛋白的降解机制。主要开展内容和结果如下:研究了冷藏草鱼肉质构劣化和胶原蛋白变化的关系。测定了冷藏鱼肉的剪切力、持水力、汁液流失、p H值、鱼肉组织结构和胶原蛋白溶解性等指标,并进行了相关性分析,同时测定了冷藏鱼肉蒸煮后剪切力、蒸煮损失率和热溶性蛋白的变化,探究了胶原蛋白变化规律与鱼肉质构劣化的关系。结果表明:鱼肉的剪切力在冷藏前5天显著下降了43.29%(P<0.05),并伴随着鱼肉的持水力下降和汁液流失;从冷藏第1天,结缔组织与肌纤维开始分离,总胶原蛋白和酸不溶性胶原蛋白含量减少;热溶性胶原蛋白的增加加剧了冷藏鱼肉蒸煮后剪切力的下降;皮尔相关性分析表明,冷藏鱼肉中总胶原蛋白、酸不溶性胶原蛋白含量与剪切力呈显著相关(P<0.05)。为探明参与冷藏草鱼肉胶原蛋白降解的内源性蛋白酶,通过明胶酶谱技术,确定了胶原降解酶的类型、分子量和最适p H值。在此基础上,研究了冷藏鱼肉中胶原降解酶活性变化与胶原蛋白降解的关系。利用半胱氨酸蛋白酶抑制剂(E-64)、金属蛋白酶抑制剂(Phen)和丝氨酸蛋白酶抑制剂(PMSF)构建不同类型胶原降解酶的抑制模型,以胶原降解酶活性、总胶原蛋白含量、结缔组织和剪切力为指标,探讨了胶原降解酶在冷藏鱼肉胶原蛋白降解中的作用。结果表明:草鱼肉中存在3种胶原降解酶,金属蛋白酶(66k Da和68 k Da)、丝氨酸蛋白酶(250 k Da)和半胱氨酸蛋白酶(29 k Da);Phen、PMSF和E-64浸泡草鱼肉处理后,胶原降解酶活性在冷藏过程中被显著抑制(P<0.05);金属蛋白酶和丝氨酸蛋白酶对冷藏前3天草鱼肉中胶原蛋白的降解起关键作用,而半胱氨酸蛋白酶在3天后发挥作用;与对照组相比,PMSF和E-64处理组中鱼肉的剪切力在冷藏11天后分别增加了19.68%和24.33%,而Phen处理组中剪切力增加了49.89%;在冷藏草鱼肉胶原蛋白降解中,金属蛋白酶起主导作用,半胱氨酸蛋白酶和丝氨酸蛋白酶起次要作用。为解析冷藏鱼肉中胶原降解酶对胶原蛋白的Docetaxel纯度降解机制,对关键性胶原降解酶进行了分离和质谱(LC-MS/MS)鉴定。结果表明:通过30%～70%硫酸铵盐析和柱层析(DEAESepharose、Phenyl-Sepharose和Gelatin-Sepharose),从草鱼肌肉中分离出一种分子量为66 k Da的金属蛋白酶;质谱分析得出16个片段(97个氨基酸)与草鱼基质金属蛋白酶-2(MMP-2)完全一致,证明纯化的金属蛋白酶为MMP-2;采用DEAE-Sepharose和Gelatin-Sepharose两步层析,分离了一种高分子量(250k Da)丝氨酸蛋白酶(SP);采用70%～90%硫酸盐析、SP Sephadex C-50离子交换层析、SP-Sepharose离子交换层析和ConA Sepharose亲和层析技术,分离到一种N-糖基化的半胱氨酸蛋白酶(29 k Da);经质谱分析得出6个片段(55个氨基酸)与草鱼组织蛋白酶L序列完全一致,证明纯化的半胱氨酸蛋白酶是组织蛋白酶L(CL)。从分子水平解析了三种胶原降解酶对胶原纤维、胶原蛋白单体和明胶的降解机制。利用CL、MMP-2和SP建立单酶、酶组合和顺序作用的体外模拟消化体系,通过扫描电子显微镜、傅里叶变换红外光谱、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳和化学分析等技术对酶解前后的胶原蛋白进行了分析。结果表明:在胶原纤维解离过程中,CL、MMP-2和SP都能降解蛋白聚糖中的核心蛋白,释放糖胺聚糖(GAGs),而MMP-BMN 673分子量2和SP能够切除胶原蛋白端肽释放羟赖氨酸吡啶啉(PYD)并降解胶原蛋白单体。蛋白聚糖的降解可以促进胶原纤维被MMP-2和SP降解。MMP-2和SP具有较强的胶原蛋白酶活性,而CL的胶原酶活性较弱。在胶原纤维、胶原蛋白单体和明胶的分解中,MMP-2分解能力最强,SP次之,而CL最弱。在体外模拟消化实验中MMP-2、SP和CL对胶原蛋白的降解模式与冷藏草鱼肉中胶原蛋白的降解程度基本一致,证实了三种胶原降解酶是引起鱼肉质构劣化中胶原蛋白降解的主要原因。本研究明确了胶原蛋白降解是引起冷藏草鱼肉质构劣化的重要原因,发现金属蛋白酶、丝氨酸蛋白酶和半胱氨酸蛋白酶是引起胶原蛋白降解的主要蛋白酶。对CL、MMP-2和SP进行了纯化和鉴定,从分子水平解析了三种胶原降解酶对胶原蛋白的降解作用。本研究进一步揭示了冷藏草鱼肉质构劣化的本质,也为解决淡水鱼肉质构劣化的技术难题提供了理论依据,对于促进淡水鱼加工产品品质提升和产业发展具有重要现实意义。