蛋白质糖基化是生物体内细胞最常见lung immune cells的翻译后修饰,不仅对蛋白质生物学功能发挥起着重要的作用,而且糖基化的结构和表达量的改变与人类免疫、肿瘤疾病、抗体药物的活性密切相关。人类蛋白质的糖基化主要分为N-糖基化和O-糖基化2种类型。基于质谱的糖链结构解析和功能为对象的糖链定性分析研究已取得了长足的技术进步。但因糖链结构复杂微不均一性、非模板特性、高度的动态性,加之标准品难以合成,高灵敏、精确的糖链定量分析是蛋白质糖基化和筛选特异性糖链生物标志物研究领域中所面临的科学瓶颈。基于液质联用技术的化学同位素标记已成为糖组学微量糖链的定性和定量分析的主流技术。已报道的糖链定量方法一般是将糖链切掉分离纯化后,并进行柱前衍生化。虽然这些方法可以在一定程度上提高糖链分析的选择性和灵敏度,但衍生化试剂的化学反应条件较难控制,易产生副产物,不同糖链结构需要摸索不同的衍生化条件,不仅容易发生去糖基化现象,而且需要多步程序其手续繁琐费时。另外,根据酶切的种类只局限于单一的N-糖链。所以亟待开发N-/O-糖链同时高灵敏、高选择性定量分析新方法。鉴于此,本研究基于非特异性链酶蛋白酶E(Pronase E)酶切反应,以N-/O-糖链为分析对象,设计并开发了一种带有同位素丙半胱氨酸结构可靶向识别氨基官能团的新型质谱探针,d0-BOTC(3-benzoyl-2-oxothiazolidine-4-carboxylic acid)和d5-BOTC(3-(2,3,4,5,6-pentadeuteriobenzoyl)-2-oxothiazolidine-4-carboxylate acid)。并建立了一种基于d0/d5-BOTC衍生化同时相对定量N-/O-糖链高灵敏、高选择性的UHPLC-HRMS新方法,并将其应用于核糖核酸酶B、西妥昔单抗的糖链定量分析及急性心梗患者血清中糖链生物标志物的筛选。(1)首先,开发了一种以丙半胱氨酸为母核结构的新型同位素质谱探针d0/d5-BOTC,使用~1HNMR、~(13)CNMR、HPLC和HRMS等对结构进行了表征。利用非特异性链酶蛋白酶E将N-/O-连接糖蛋白上结合的肽段同时一次性酶解成只带一个氨基酸的糖氨酸,因本探针结构中带有羧基基团,可靶向标记糖氨酸的氨基官能团,d0/d5-同位素标记的糖链因在质谱上m/z相差5 Da且具有相同的离子化效率,可以通过比较这一对峰的相对丰度,进行糖链相对定量。然后,利用D-葡糖胺作为单糖模型评估了d0/d5-BOTC标记效率,并对不同的反应温度及反应时间进行了考察。结果,在质谱中观测到带同位素结构的特征碎片离子m/z 77.2,当碰撞能量为70 e V时,离子强度最大,检测限(S/N=3)为10 attomole。(2)以唾液酸糖肽(SGP)为复合糖链模型,使用非特异性链酶蛋白酶E将SGP酶解成含有一个天冬酰胺的糖氨酸(SGA),开发了一种基于同位素d0/d5-BOTC探针标记糖链SGA相对定量高灵敏、高选择性的UHPLC-HRMS方法。并对反应条件进行了优化,通过d0/d5和d5/d0不同的理论值与实测响应强度比值绘制标准曲线,并以不同摩尔比混合后进行准确度的考察。结果,d0/d5(d5/d0)在0.03-10范围内均呈现良好的线性关系(R~2≥0.9992),重现性在0.98-10.76%之间,检测限为15 fmol。(3)以高甘露糖型糖蛋白核糖核酸酶B(RNase B)为模型,开发了基于反相色谱结合Q-Orbitrap HRMS糖链相对定量方法。对质谱采集模式,色谱柱,流动相及洗脱方法均进行了考察,并以不同摩尔比混合后(d0/d5=1:2;2:1)理论值与实测响应值进行了比较。结果d0/d5-同位素标记糖链实测丰度值与理论值基本一致。此外,使用五种色谱柱在不同洗脱条件下考察了M7N2糖链同分异构体的分离,结果,在Shield RP18色谱柱B=0-10%(0-10 min)洗脱条件下成功分离糖链异构体。(4)建立了基于链酶蛋白酶E酶解西妥昔单抗糖链相对定量HILIC-Q-Orbitrap HRMS新方法。通过对糖链释放前处理、衍生化反应条件、色谱柱、流动相、进样量及不同洗脱梯度的考察,验证了方法的有效性。此外,通过d0/d5-BOTC标记单抗中糖链以不同摩尔比混合后(d0/d5=5:1;3:1;1:1;1:3;1:5)进行检测,验证了方法的准确性。利用Tracefinder软件建立d0/d5-同位素标记单抗糖链数据库进行匹配确认糖链种LXH254化学结构类,最终成功解析出13种糖链,对单抗药物中糖链质控分析、种类解析及功能研究提供了新方法。(5)构建了基于链酶蛋白酶E酶切急性心梗(AMI)患者血清中糖链生物标志物相对定量筛选UHPLC-HRMS新方法,结果发现H4N4F3SA、H4N6F2、H4N6SA、H4N6F3和H5N4FSA五种糖链含量在健康组和AMI患者中具有显著性差异(p<0.0005),均呈现糖链含量减少趋势;ROC曲线中H4N6SA的AUC值为0.9039(敏感度=100%,特异度=76.67%),H5N4FSA的AUC值为0.9869(敏感度=96.55%,特异度=93.10%),H4N6F2的AUC值为0.9138(敏感度=96.55%,特异度=75.86购买AZD2281%),为早期预警和诊断心梗疾病提供了新的策略及临床数据支撑。综上所述,本研究开发了一种同位素标记新型质谱探针d0/d5-BOTC,基于非特异性链酶蛋白酶E酶切建立了同时相对定量N-/O-糖链高灵敏度、高选择性UHPLC-HRMS新方法。该方法准确、精准,不仅可应用于抗体药物的糖链分析,而且可筛选和鉴定人体血清中急性心梗糖链生物标志物。为抗体药物的稳定性和生物活性研究提供了一种新的方法,为临床上糖链新生理功能和差异性糖组学研究提供了新的策略。