1． 1 主要试剂
人胶质瘤细胞系( U-118 MG、U-87 MG、LN-229、A-172) 购自美国 ATCC 细胞库( American Type Culture Collection) ，DAB 检测试剂盒购自万类生物。胎牛血清、DMEM 细胞培养基、胰蛋白酶、LipofectamineTM2000 ( Invitrogen) ，总蛋白提取试剂盒( 碧云天) ，MTT 试剂盒 ( Sigma ) ，Transwell 小 室 ( Millipore ) ，鼠 抗 人 TＲIM29、α-tubulin、p-AKT 及 AKT 一抗( Cell Signaling Technology) ，鼠抗人 Ki67 一抗( BD Biosciences) ，辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠二抗( Life) ，对照组 ( shScramble) 病毒及 TＲIM29 干扰病毒( shTＲIM29) 由上海吉玛基因公司构建，
1． 2 临床资料MK-1775 IC50
选取 2007 年 1 月至 2012 年 9 月陆军军医大学第三附属医院神经外科手术切除的胶质瘤组织标本 56 例。所选病例术前均未行放化疗，术后病理组织学检查证实为胶质瘤。包括男性 34 例，女性 20 例; 年龄31 ～ 67( 45． 3 ± 9． 3) 岁，其中≤ 40 岁20 例，＞ 40 岁 36 例。据WHO 分级，Ⅰ ～ Ⅱ期26 例，Ⅲ期17 例，Ⅳ期13 例，见表 2。同时另取由高血压所导致的脑出血行正常脑组织切除减压患者标本 16 例为对照组。并于术中收集脑胶质母细胞瘤组织、癌旁组织及正常脑组织( 对照) 各 4 例用以 TＲIM29 蛋白表达检测。
1． 3 方法
1． 3． 1 免疫组化 采用 DAB 检测试剂盒检测 TＲIM29 和 Ki67 的表达情况。结果判定标准: 根据阳性细胞所占视野面积百分比评分为 1 ( ＜ 10% ) ， 2( 10% ～ 50% ) ，3( ＞ 50% ～ 75% ) 和 4 ( ＞ 75% ) 。染色强度分为无显色为 0 分，淡黄色为 1 分，黄色为2 分，棕黄色为 3 分。染色指数为两者计分相乘，0 ～ 1 分: “－ ”; 2 ～ 3 分: “ + ”; 4 ～ 6 分: “ + + ”; ＞ 6 分: “ +++ ”。 ＞ 4 判定为高表达，≤4 判定为低表达。
1． 3． 2 细胞培养 胶质瘤细胞株 U-118 MG、U-87 MG、LN-229、A-172 培养于恒定 37 ℃ ，5% CO2 浓度的细胞培养箱。细胞每 2 天更换 1 次培养基，对数生长期传代。
1． 3． 3 慢病毒感染 U-87 MG 细胞 取对数期生长良好的 U-87 MG 细胞，以每孔 5 × 104 细胞数接种于12 孔板。并将其分为空白对照组、shScramble 组( 阴性对照组) 及 shTＲIM29 组( 实验组) 。于 37 ℃ 、5% CO2的培养箱中培养 24 h，待细胞密度达到约 40% 时，将 shScrambRapamycinle 及 shTＲIM29 慢病毒以感染复数值 3 分别感染对照组与实验组细胞。24 h 后，更换培养液并加入 3 μg / mL 嘌呤霉素筛选获得感染成功的阳性细胞，待细胞生长状态稳定后，改用含低浓度嘌呤霉素的 培养基维持培养，经扩大培养后即可获得稳定敲低的 各组细胞株。
1． 3． 4 蛋白质提取以及 Western blot 检测 应用总蛋白提取试剂盒提取各细胞及组织总蛋白，利用 BCA 法检测蛋白质浓度。通过 10% 的 SDS-PAGE 凝胶电泳各组蛋白质，并转膜至 PVDF 膜，以 5% 脱脂牛奶室温封闭 2 h。再加入1∶ 1 000 鼠抗人TＲIM29 抗体及鼠抗人 1 ∶ 1 000 α-tubulin 抗体，4 ℃ 中孵育过夜。次日 TBST 洗膜3 次，每次5 min，室温下以1∶ 10 000 辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠二抗孵育 2 h，TBST 洗涤
3 次，每次 5 min，利用 ECL 化学发光液显影。
1． 3． 5 MTT 细胞增殖实验 利用 MTT 实验检测 TＲIM29 对 U-87 MG 细胞增殖的影响。细胞分为空白对照组、shScramble 组( 阴性对照组) 及 shTＲIM29 组 ( 实验组) ，将各组 U-87 MG 细胞接种于 96 孔板内，分别于 0、1、2、3、4、5 d 每孔中加入 5 mg / mL 的 MTT 试剂 10 μL，避光于 37 ℃孵育 4 h，吸去上清，加入 200 μL DMSO，室温震荡 10 min 后，于波长 560 nm 处测定光密度值［D( 560) ］。
1． 3． 6 肿瘤细胞克隆形成实验 1． 2% Softagar 配制: 称取 1． 2 g 软琼脂，定容至 100 mL，经高压处理后置于60 ℃ 留存。底层胶: 将500 μL 2 × DMEM 培养和等体积的 1 × DMEM 培养基混匀后平铺于 6 孔板，等待冷却待用。上层胶: 取 5 mL 离心管，加入 2 mL 1 × DMEM 培养基，然后将各组细胞消化计数，按空白对照组、shScramble 组( 阴性对照组) 及 shTＲIM29 组( 实验组) 每组 1 000 个细胞加入离心管中进行悬浮; 再准备另外一只离心管，向其中分别加入 1． 5 mL 2 × DMEM 和等体积的 1． 2% Softagar，充分混匀后吸取 2 mL 于以上培养基充分混匀。最后向孔中加入 1． 5 mL混合液作为上层胶，每组重复 3 次，待胶充分凝固后放于 37 ℃ 培养箱中进行培养。14 ～ 21 d 后，用 MTT 染色 30 min 进行拍照检测。GDC-0068
1． 3． 7 Transwell 实验检测细胞的迁移能力 分别取对数生长期的空白对照组、shScramble 组( 阴性对照组) 及 shTＲIM29 组( 实验组) U-87 MG 细胞。经消化、离心后，用新鲜培养基重悬并进行细胞计数，以 1 × 105 / 孔接种于小室的上室，改用 1% 的培养基进行饥饿培养，下室加入含 10% 胎牛血清的 DMEM 培养基， 孵箱培养后，取出小室进行用多聚甲醛固定 15 min， PBS 洗涤 3 次 × 5 min，结晶紫染色 20 min，PBS 洗涤 3 次 × 5 min，干燥后置于显微镜下观察并计数。
1． 3． 8 裸鼠体内成瘤实验 选取 3 ～ 4 周龄，由西南大学家蚕基因生物学国家重点实验室提供的雌性裸鼠进行实验。取对数生长期的空白对照组、shScramble组( 阴性对照组) 及 shTＲIM29 组( 实验组) U87-MG 细胞，以 PBS 调整细胞数为 4 × 105 个/ mL，取 0． 1 mL 细胞悬液注射于小鼠前肢背部皮下，共 18 只，每组 6 只。之后每隔 5 d 观测裸鼠皮下肿瘤生长情况，并以游标卡尺测量肿瘤体积。在第 30 天时，通过颈椎脱臼法处死各组小鼠，并拍照测量肿瘤体积( 长径× 短径2 × 0． 5) 。
1.4 统计学分析
采用 SPSS 19． 0 统计软件进行数据分析，每项实验至少重复 3 次，计量资料以 x珋± s 表示，两组间比较采用 t 检验; 相关性分析采用 Spearman 相关分析。检验水准: α = 0． 05。